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Talia
Nuovo Arrivato
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Prov.: Napoli
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 Inserito il - 05 gennaio 2010 : 15:53:16
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Salve,
sto studiando per l'esame di microbiologia avanzata al secondo anno di magistrale in biotecnologie mediche e mi sono imbattuta in questa strategia di mutagenesi sito-specifica,ma non ho trovato informazioni chiarificatorie.
Qualcuno saprebbe riassumermi gli step di questo protocollo?
Grazie per l'eventuale aiuto!
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Talietta |
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domi84
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Talia
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
35 Messaggi |
Inserito il - 06 gennaio 2010 : 14:42:47
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Ciao,grazie!
Ho letto,ma la spiegazione credo sia relativa a mutagenesi per PCR che è diversa da quick changes mutagenesi come spiegato dalla mia prof.
Oddio non lo so...nella tecnica che studiavo le parlava di dna plasmidico trasformato in cellule dam+.
Dice che il Dna stampo(ossia plasmidico) subisce metilazione e che i primers utilizzati contengono la mutazione che vogliamo inserire.
In seguito a PCR con questi primer su Dna plasmidico si ottengono i filamenti di nostro interesse ed alla fine...il Dna che era servito da stampo e che era metilato viene degradato da Dpn I.
In tutto ciò non so se ho scritto una cosa corretta e sensata,ma lei così si è espressa!:( |
Talietta |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 06 gennaio 2010 : 22:18:56
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Devi leggere più giù, dove un altro utente chiede della "sostituzione con PCR".
Prendi batteri dam+ (quindi che hanno la metilasi) che amplificano il tuo plasmide, poi estrai i plasmidi dai batteri (che sarranno metilati). Fai una PCR per la mutagenesi, quindi avrai un plasmide "vecchio", senza la mutazione e che è metilato, e uno "nuovo", con la mutazione e non è metilato. Poi aggiungi DpnI che taglia il DNA metilato e quindi ottieni una soluzione con il plasmide mutato puro. (ovviamente nel plasmide ci sarà il gene di interesse che vai a mutare.)
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Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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Talia
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
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35 Messaggi |
Inserito il - 07 gennaio 2010 : 18:20:22
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ok,grazie mille!
Quindi in linea di massima qualcosa avevo capito,mi mancava qualche tassello!:)
Sei stato gentilissimo! |
Talietta |
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quick changes mutagenesi
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