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ukitel
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78 Messaggi |
 Inserito il - 19 gennaio 2010 : 13:30:18
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Il discorso è lo stesso che ho fatto per quest'altra discussione: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=16291
Molto spesso questo problema è dovuto alla enorme lunghezza dei frammenti amplificati in campioni ematici... In paraffina, pfa, e generalmente in tutti i tessuti fissati, soprattutto con agenti cross-linkanti non puoi permetterti questa lunghezza.
Un buon compromesso è la formalina neutra tamponata, che ti permette un buon livello di fissazione per analisi istologiche, ma al tempo stesso ti preserva senza molti danni sia DNA che RNA.
I fissativi in questione modificano chimicamente le basi, le legano tra loro, e soprattutto li frammentano. Sebbene alcuni accorgimenti permettono di "revertire" queste modificazioni (quelle chimiche), alla frammentazione non c'è soluzione.
E' per questo motivo che non puoi amplificare frammenti lunghi... E scommetto che il frammento da te amplificato è lunghetto.
Un altro punto critico è l'estrazione. Scegli con cura il kit che usi, perché non sono tutti efficienti o equivalenti. Per esempio... assicurati che il tuo kit utilizzi la proteinasi K (alcuni utilizzano metodi alternativi per essere più "rispettosi" con l'RNA), perché ti serve che il tuo DNA, prima dell'estrazione, sia liberato il più possibile dagli istoni, altrimenti la resa cala molto.
Un altro problema che puoi incontrare sempre a causa di queste modificazioni sono le "strutture secondarie" proprio perché vengono legati tra loro, spezzati, ecc, questi acidi nucleici tendono a formare strutture contorte, che ostacolano la polimerasi, ma in questo caso un po' di DMSO basta a "sciogliere" le matasse :D
Non ti preoccupare che per il resto non c'è bisogno di cambiare nulla.
Il problema non è nella tua pcr, ma a monte.
Ti consiglierei di esaminare nell'ordine:
- preparazione e fissazione del campione
- estrazione del DNA
- lunghezza frammento
- DMSO nella mix
Se queste cose non funzionano, allora puoi farti domande riguardo i tuoi reagenti di PCR, ma da quanto ne so non ci sono indicazioni riguardo taq particolari o simili, anzi... |
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prendere il "paraffinato" per il verso giusto
Didattica e Relazioni
e giustamente vi giro un quesito abbastanza rognoso!!!
Ho iniziato a lavorare da poco con DNA estratto da materiale paraffinato..e mi sono subito dovuto "dimenticare" delle belle amplificazioni che riuscivo ad ottenere da DNA genomico estratto da campioni ematici!!! cerco qualcuno/na che possa darmi consigli su che tipologia di mix usare (soprattutto che tipo di Taq!!)... Sò che lavorare con i paraffinati nn è molto gratificante ma nn ne posso fare a meno..
