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Discussione

ale_09_86
Nuovo Arrivato

Prov.: ct
Citt�: catania

4 Messaggi

Inserito il - 11 marzo 2010 : 09:42:08

Salve a tutti, ragazzi qualcuno gentilmente saprebbe dirmi perch� per clonare un frammento di cDNA in un vettore pQE30 devo prima clonarlo in TOPO-TA.
Vi ringrazio infinitamente, alessandro.........

domi84
Moderatore

Citt�: Glasgow

1724 Messaggi

Inserito il - 11 marzo 2010 : 10:56:58

Io ho fatto clonaggi in pQE30....ma non l'ho clonato prima in TOPO-TA (cos'�?!)

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...

Schuldiner86
Utente Junior

Prov.: Viterbo
Citt�: Bologna

581 Messaggi

Inserito il - 11 marzo 2010 : 11:44:56

Io l'ho usato per la tesi. Praticamente si basa sul fatto che la Taq polimerasi in seguito a una PCR aggiunge sempre un A al 3' dell'amplificato. Il TOPO-TA � un vettore che � linearizzato e presenta alle estremit� 5' due topoisomerasi attaccate con un legame Y-P a due T overhanging. Praticamente nel momento in cui metti insieme l'amplificato di PCR con il vettore le A e le T si appaiano e la topoisomerasi catalizza la formazione dei legami fosfodiestere tra vettore ed amplificato. Praticamente il vantaggio � che ti eviti il passaggio della digestione con la conseguente perdita in resa. Quindi il TOPO-TA in genere si usa quando ci stanno problemi per enzimi di restrizione oppure pi� solitamente quando l'amplificato in PCR non � in quantit� grandi. Se si evita la digestione ed il passaggio in colonna per la purificazione si ha pi� DNA di inserto in partenza, che poi fai amplificare in coli. Spero di essermi spiegato.

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 11 marzo 2010 : 13:34:13

Beh dovresti dirci meglio dove hai sentito questa cosa e cosa � stato fatto di preciso.
Come ti � stato detto per clonare in pQE30 non � necessario passare prima da TOPO-TA, ma questo sar� stato fatto per esigenze particolari. Senza sapere la strategia di clonaggio per� � impossibile risponderti.