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cathy
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11 Messaggi |
 Inserito il - 02 dicembre 2009 : 11:16:52
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Ciao,
ho problemi con il western blotting da diversi mesi...la lastra esce completamente bianca. Lavoro su lisati tissutali di cuore. Con il rosso ponceau si vedono le proteine sulla membrana e ho quindi pensato che fosse un problema di concentrazione di anticorpo per cui ho utilizzato diversi tipi di concentrazioni e cambiato anche anticorpi. Ho provato anche a cambiare ECL e tempo di esposizione della lastra ma il risultato è sempre lo stesso. Grazie a tutti anticipatamente
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2009 : 11:27:30
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| quando dici bianca intendi che non si vedono le tue bande o la lastra proprio non sviluppa minimamente???? prova ad esporre la lastra alla luce del sole e poi sviluppala. se non si scurisce il problema è nel liquido di sviluppo probabilmente. |
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cathy
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2009 : 11:47:54
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| la lastra sviluppa ma non ci sono bande,comunque ho anche cambiato i liquidi di sviluppo. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2009 : 12:43:59
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Dovresti dirci se hai provato con anticorpi "robusti" tipo quelli
contro housekeepings, quanto incubi e a che concentrazioni, come
fai i lavaggi e come conservi le membrane. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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cathy
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2009 : 13:04:58
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| Ho provato con actina concentrata 1:1000, 1:800 e 1:500, lasciando incubare over night a 4°C oppure 1-2 h in agitazione a T ambiente ma nulla. Faccio 3 lavaggi con TPBS per 10 minuti e un ultimo di 5 minuti con PBS puro (ho anche ridotto i tempi di lavaggi riducendoli a 5 minuti pensando che lavassi un pò troppo), ho anche cambiato facendo 4 lavaggi di 10 minuti ciascuno con TBS+ 1% milk |
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2009 : 16:04:10
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| Hai cambiato il secondario???? |
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cathy
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11 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2009 : 16:33:54
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| si anch'esso a diverse concentrazioni |
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Saretta
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Provincia di Roma
263 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2009 : 18:49:52
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| Il fondo del gel però lo vedi quando sviluppi la lastra? |
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cathy
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2009 : 14:28:27
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| No, è completamente limpida |
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Saretta
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Provincia di Roma
263 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2009 : 20:59:24
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| Mmmmm potresti provare con un altro ECL... |
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2009 : 18:25:33
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| il secondario è giusto??? |
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cathy
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 23 dicembre 2009 : 11:06:49
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Il secondario è quello giusto! Ho provato altri ECL ma nulla...sono disperata!!! |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 23 dicembre 2009 : 21:17:31
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| metti 1 ml di ECL in eppendorf e poi vai in camera oscura. metti 1 ul di secondario nell'eppendorf con ECL e vedi se avviene la reazione. così escludi sia un problema di secondario (molto probabile) che di ECL |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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cathy
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 15:07:06
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Salve ragazzi...dopo tante prove ho capito che erano i liquidi di sviluppo, infatti ho utilizzato liquidi non miei e ho risolto il problema...mah!!! Ora però ciò che osservo è un segnale poco nitido come se fosse sfocato anche cambiando concentrazioni di Ab inoltre c'è molto background e le lastre vengono molto scure a cosa potrebbe essere dovuto?
Grazie mille per il vostro aiuto |
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simolab
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2010 : 14:12:22
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ciao , l' eccessivo background potrebbe dipendere dalla saturatione, tu che usi latte o bsa? e a che concentrazione?
per quanto riguarda la lastra, per caso sviluppi con la luce rossa in camera oscura? se è così cerca di limitare al massimo la luce e di tenere la lastra un minuto esatto nel liquido di sviluppo, non di più, con le lastre anch'io ho avuto il tuo stesso problema, e mi sono resa conto che era proprio la luce rossa...
ciao ciao |
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cathy
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2010 : 14:51:49
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Utilizzo latte al 5% + tween 0.5% per 1h a temperatura ambiente. Proverò a ridurre l'uso della luce... speriamo bene 
Ciao |
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simolab
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2010 : 16:06:55
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| puoi provare a saturare con BSA AL 5% soprattutto se usi una membrana in pvdf che va attivata con metanolo.. |
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Saretta
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Provincia di Roma
263 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2010 : 17:41:58
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Altro quesito: vi è mai capitato che invece di belle bande ottenete delle farfalle diciamo?
A cosa può essere dovuto? 
Grazie! |
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WB
Didattica e Relazioni
