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Luis 22
Utente
Città: Bari
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 Inserito il - 07 maggio 2010 : 18:25:59
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Salve!
Dopo esser riuscito ad ottimizzare la precendente proteina (e vi ringrazio nuovamente), mi ritrovo a testare nuovi anticorpi contro una serie di altre proteine.
Per ora sto iniziando ad ottimizzare ND6 (NADH dehydrogenase, subunit 6 (complex I)) e ND1 (NADH dehydrogenase, subunit 1 (complex I)).
Inizio con ND6.
Il problema con questa proteina è che osservo più bande, di cui almeno 2 ben evidenti (intorno a 72 e 55 kDa).
E questo succede ottimizzando al meglio di anticorpi e il latte, tanto è vero che il filtro esce abbastanza pulito.
In letteratura nel ratto questa proteina risulta di 18 kDa circa.
Sempre in letteratura inoltre si parla di come i complessi respiratori, oltre ad essere già loro stessi "complessi", possono anche formare supercomplessi aggregandosi ulteriormente.
A questo punto mi sta venendo il dubbio che le bande che osservo possano essere il risultato di complessi (più pesanti) in cui la proteina è presente.
Prima di caricare utilizzo condizioni denaturanti (Sample-buffer con Beta-mercaptoetanolo, 5-10 minuti a 100°C), quindi ora non so se questa mia teoria possa risultare esatta.
Avete esperienza in western su proteine facenti parte di complessi o supercomplessi? Ci sono procedure preventive da effettuare?
Passiamo ora a ND1.
Anche questa fa parte di un complesso, però qui il problema è che per vedere una invisibile banda devo aspettare 10 minuti!
E tra le varie prove sono arrivato a 1/500 di primario e 1/2500 di secondario.
Nonostante questo, il risultato finale è deludente. Si intravedono anche qui più bande (e qui ripropongo il quesito di prima), una leggermente meglio, ma alla fine niente di davvero acquisibile e soprattutto 10 minuti sono davvero troppi!
In questo caso, stavo pensando: potrei aumentare la quantità di proteina caricata? Al momento ne carico 10 microgrammi.
Grazie già da ora!
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
 Inserito il - 07 maggio 2010 : 23:22:29
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Ciao. Sinceramente non sono un esperto di wb, ne ho fatti pochi in vita mia. però sono sicuro del fatto che con la sds page le singole molecole di un complesso multiproteico vengono efficacemente separate le une dalle altre.
Per quanto riguarda l'acquisizione o esposizione dipende con che cosa lo fai.. se ti servi di lastre fotografiche (come ho fatto io) dieci minuti nn sono così tanti... Semmai notavo che usi il primario a 1/500... forse un pò troppo? hai provato a diluirlo di più? |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2010 : 15:24:38
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
Ciao. Sinceramente non sono un esperto di wb, ne ho fatti pochi in vita mia. però sono sicuro del fatto che con la sds page le singole molecole di un complesso multiproteico vengono efficacemente separate le une dalle altre.
Per quanto riguarda l'acquisizione o esposizione dipende con che cosa lo fai.. se ti servi di lastre fotografiche (come ho fatto io) dieci minuti nn sono così tanti... Semmai notavo che usi il primario a 1/500... forse un pò troppo? hai provato a diluirlo di più?
Si, sono partito da diluizioni molto più diluite, ma segnali leggerissimi e solo dopo 10-15 minuti.
Uso anch'io le lastre fotografiche, ma in genere le varie proteine che seguo le osservo in un range tra 5 secondi - 2 minuti. |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2010 : 16:21:13
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Citazione:
A questo punto mi sta venendo il dubbio che le bande che osservo possano essere il risultato di complessi (più pesanti) in cui la proteina è presente.
Prima di caricare utilizzo condizioni denaturanti (Sample-buffer con Beta-mercaptoetanolo, 5-10 minuti a 100°C), quindi ora non so se questa mia teoria possa risultare esatta.
Ciao, non ho esperienza di proteine che formano dei complessi e supercomplessi con altre proteine, ma mi è capitato il caso in cui la mia proteina formava degli omodimeri e dei trimeri.
Per poter separare i complessi non mi è bastato usare agenti riducenti come il beta-mercapto ma ho dovuto usare nel sample buffer urea (agente denaturante) alla concentrazione finale di 4M. Considera però che l'urea ha effetti sulla corsa per cui i campioni correvano un pò storti, ma alla fine sono riuscita a vedere la singola proteina. Il fatto che tu veda delle bande a 72 e a 55 mi fa pensare che anche la tua proteina possa formare degli aggregati in quanto sono due multipli di 18 (in realtà 55 non lo è ma considero che l'altezza delle bande non è precisa al 100%)
Citazione:
A questo punto mi sta venendo il dubbio che le bande che osservo possano essere il risultato di complessi (più pesanti) in cui la proteina è presente.
Prima di caricare utilizzo condizioni denaturanti (Sample-buffer con Beta-mercaptoetanolo, 5-10 minuti a 100°C), quindi ora non so se questa mia teoria possa risultare esatta.
Certo che la puoi aumentare, 10 ug non sono poi tanto, io nei miei western non metto meno di 30ug e già ho qualche difficoltà a vedere la proteina. A volte mi è capitato di incubare il filtro O.N. con il primario diluito 1:1000 perchè altrimenti non si vedeva nulla.
Anche secondo me 10 minuti di esposizione non sono poi eccessivi se la tua proteina è poco espressa, è vero pure che a quelle conc. di anticorpi che usi dovresti vederla bene e rapidamente.
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2010 : 23:52:57
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Grazie per la precisa risposta!
Ottima idea quella dell'urea, vedrò se è applicabile al mio caso.
Per storti intendi che il fronte di migrazione non era dritto? O c'era proprio un problema di bande deformi alla fine? |
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angemore
Nuovo Arrivato
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Inserito il - 11 maggio 2010 : 10:58:54
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intendo che le bande vengono un pò deformi.
Comunque nel tuo caso potresti cominciare con una concentrazione di urea minore, ad esempio 2M..dovrebbe essere sufficiente.
Fammi sapere come va se decidi di provare! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2010 : 17:56:22
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Ma non è un po' troppo concentrata l'urea?
Ho provato a fare un po' di calcoli per le diluizioni 4 M e 2 M e ho notato che per volumi piccoli (che poi si usano per il SB), è difficoltoso sciogliere tutta l'urea per quella concentrazione. |
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2010 : 22:28:34
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Allora, ho controllato e io ho usato urea ad una concentrazione finale 2M.
devi partire da uno stock più concentrato perchè ovviamente come dici anche tu farla sciogliere nel piccolo volume del SB non è possibile. Io sono partita da uno stock concentrato 8M ma puoi partire anche da 6M ad esempio. Per farla sciogliere meglio mettila a 37°C. Poi ho preparato un SB 2X (partendo dal 5x) con urea 4M che, una volta diluito con il mio campione, aveva una concentrazione finale di urea 2M. Non so se mi sono spiegata bene, nel caso mandami un messaggio privato. Ciao |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 12 maggio 2010 : 00:20:53
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Credo di aver capito.
Domani mi faccio un po' di calcoli e ti faccio sapere!
Grazie! |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 12 maggio 2010 : 16:33:53
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ciao Luis, ti posso dare qualche dritta.
io faccio wb sulle subunità del complesso IV (citocromo c ossidasi) e anche io ne ho perso del tempo prima di mettere a punto la metodica. quello che posso dirti è:
- aumentare quantità di campione: io carico 80-100 ug di estratto totale e 50 ug di frazione mitocondriale arricchita;
- anche io ho notato che solo sds e mercaptoetanolo non sono sufficienti a separare i complessi, soprattutto se immersi in membrane.Quello che faccio io dipende dal tipo di campione:
cellule: liso in RIPA buffer, sonico 3 volte, aggiungo simple buffer con sds e mercapto, denaturo
tessuti: centrifugo 10' a 800g per arricchire il surnatante di mitocondri, 3 freeze &thaw, sonico, aggiungo simple buffer e denaturo.
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2010 : 01:07:57
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Citazione:
Messaggio inserito da darkene
ciao Luis, ti posso dare qualche dritta.
io faccio wb sulle subunità del complesso IV (citocromo c ossidasi) e anche io ne ho perso del tempo prima di mettere a punto la metodica. quello che posso dirti è:
- aumentare quantità di campione: io carico 80-100 ug di estratto totale e 50 ug di frazione mitocondriale arricchita;
- anche io ho notato che solo sds e mercaptoetanolo non sono sufficienti a separare i complessi, soprattutto se immersi in membrane.Quello che faccio io dipende dal tipo di campione:
cellule: liso in RIPA buffer, sonico 3 volte, aggiungo simple buffer con sds e mercapto, denaturo
tessuti: centrifugo 10' a 800g per arricchire il surnatante di mitocondri, 3 freeze &thaw, sonico, aggiungo simple buffer e denaturo.
Ciao! Grazie per la risposta!
I Western li sto facendo su omogenati totali di proteine a partire da tessuti.
Certo che 80-100 microgrammi è davvero tanto! Non so neanche se riuscirei a caricarli. Si potrebbe comunque provare.
Domani vedo cosa esce con l'urea e vediamo!
PS: non ricordo se tra gli anticorpi da saggiare c'è anche quello per la Citocromo C ossidasi...Devo controllare! |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2010 : 10:24:58
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| se fai l'omogenato in 5 volumi di tampone riesci a caricare perfettamente anche 100 ug. purtroppo le proteine mitocondriali sono poche rispetto a quelle totali. se vuoi caricare 10 ug devi per forza isolare i mitocondri. su un omogenato totale con 10 ug non vedrai mai (quasi) niente! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 17 maggio 2010 : 00:23:51
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Ho provato con l'urea!
Non è cambiato granchè! L'unica cosa che ho notato è che il filtro sembrava più pulito e che ci è voluta una esposizione più lunga per vedere le bande.
Chissà perchè!! Come dovrebbe agire l'urea?! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 17 maggio 2010 : 11:19:32
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Citazione:
Messaggio inserito da darkene
se fai l'omogenato in 5 volumi di tampone riesci a caricare perfettamente anche 100 ug. purtroppo le proteine mitocondriali sono poche rispetto a quelle totali. se vuoi caricare 10 ug devi per forza isolare i mitocondri. su un omogenato totale con 10 ug non vedrai mai (quasi) niente!
Oltre all'urea, ho fatto anche una prova caricando 40 ug. Rispetto alle altre a 10 o 20 ug si nota molto però il fatto che la migrazione è un po' difficoltosa e il trasferimento non è stato il massimo! |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 17 maggio 2010 : 12:54:38
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per la corsa non superare i 100V. Se hai ancora problemi esegui la corsa a 32 mA. per il trasferimento io non ho nessun problema (100V per 60-90 min a 4°C), e non uso urea.
un'altra cosa: stai attento che in urea le proteine (soprattutto quelle dei complessi) posso migrare ad altezze diverse rispetto alla corsa in Tris-Gly! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 17 maggio 2010 : 13:23:37
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Citazione:
Messaggio inserito da darkene
per la corsa non superare i 100V. Se hai ancora problemi esegui la corsa a 32 mA. per il trasferimento io non ho nessun problema (100V per 60-90 min a 4°C), e non uso urea.
un'altra cosa: stai attento che in urea le proteine (soprattutto quelle dei complessi) posso migrare ad altezze diverse rispetto alla corsa in Tris-Gly!
Grazie ancora per la nuova risposta!
L'urea l'ho aggiunta al sample buffer e non al buffer di corsa.
Non ho notato nessuna variazione nella corsa e neanche nelle bande per fortuna.
Il problema è che con o senza urea, la proteina ND6 continua a dare 2-3 bande (di cui 2 davvero nette) a 72 e 55 kDa. Mentre a 18 kDa, dove mi sarei aspettato la banda (rifacendomi alla letteratura), il nulla!
Per quanto riguarda la corsa, il gel l'ho mandato a 100V mentre il trasferimento a 350 mA per circa 2 ore.
Queste sono condizioni standard a cui ho sempre fatto gli altri western, anzi in realtà per la corsa elettroforetica sono arrivato a 150 V per i gel da 26 pozzetti.
Preciso anche se i gel che uso sono pre-cast Bis-Tris 4-12%...non so se ciò può influire! |
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 18 maggio 2010 : 10:32:46
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A questo punto aumentare l'urea a 4M non penso che ti varierebbe molto la situazione. Ci sono dei protocolli online per fare dei gel urea-sds page in cui per l'appunto si aggiunge l'urea nel gel stesso. Una volta l'ho provato ma è stato disastroso!!
Come ti diceva darkene l'urea ha rallentato la migrazione dei miei campioni e poi la risoluzione del gel era pessima.
Citazione:
Oltre all'urea, ho fatto anche una prova caricando 40 ug. Rispetto alle altre a 10 o 20 ug si nota molto però il fatto che la migrazione è un po' difficoltosa e il trasferimento non è stato il massimo!
Sinceramente 40ug non sono poi così tanti e non mi spiego perchè tu abbia così tante difficoltà nella corsa e nel trasferimento.
In caso puoi trasferire O.N. a 25mA in camera fredda tranquillamente.
Poi ho un altro dubbio. Se usi gel precast non hai anche un SB fornito dalla ditta stessa con cui caricare i campioni? Ti faccio un esempio, io uso quelli dell'invitrogen e ho un SB 4x specifico. I campioni, inoltre, invece che bollirli a 95°C per 5' vanno messi a 70°C per 10'(è vero pure che su questi gel ho caricato per necessità campioni trattati con il SB con B-merc. fatto da me e sono migrati bene lo stesso. |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 18 maggio 2010 : 12:18:46
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Citazione:
Messaggio inserito da angemore
A questo punto aumentare l'urea a 4M non penso che ti varierebbe molto la situazione. Ci sono dei protocolli online per fare dei gel urea-sds page in cui per l'appunto si aggiunge l'urea nel gel stesso. Una volta l'ho provato ma è stato disastroso!!
Come ti diceva darkene l'urea ha rallentato la migrazione dei miei campioni e poi la risoluzione del gel era pessima.
Citazione:
Oltre all'urea, ho fatto anche una prova caricando 40 ug. Rispetto alle altre a 10 o 20 ug si nota molto però il fatto che la migrazione è un po' difficoltosa e il trasferimento non è stato il massimo!
Sinceramente 40ug non sono poi così tanti e non mi spiego perchè tu abbia così tante difficoltà nella corsa e nel trasferimento.
In caso puoi trasferire O.N. a 25mA in camera fredda tranquillamente.
Poi ho un altro dubbio. Se usi gel precast non hai anche un SB fornito dalla ditta stessa con cui caricare i campioni? Ti faccio un esempio, io uso quelli dell'invitrogen e ho un SB 4x specifico. I campioni, inoltre, invece che bollirli a 95°C per 5' vanno messi a 70°C per 10'(è vero pure che su questi gel ho caricato per necessità campioni trattati con il SB con B-merc. fatto da me e sono migrati bene lo stesso.
No, il SB non c'entra niente con la ditta dei gel e non ha mai dato problemi in tutti i precedenti Western.
Riguardo i 40 ug, si vede subito sul gel oltre alle bande una specie di smeer, cosa che non accade a campioni di 10-20 ug.
Inoltre aumentare troppo i ug, per alcuni campioni più diluiti rischia che non riescano ad entrare nei pozzetti.
Ora per le prove sto usando gel da 18 con 30 ul massimo di caricamento, ma per gli esperimenti uso gel da 26 con 15 ul massimo. |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2010 : 12:19:47
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se vedi uno smear probabilmente ti porti dietro del DNA. centrifuga il campione al massimo dei giri per 20 min a 4°C e prendi il surnatante.
ti ripeto, carico 80-100 ug e non ho problemi di corsa. ti consiglio ti farti il gel tu, un 12-14% dovrebbe andare. sai, non mi fido tanto delle cose preconfezionate quando testo cose nuove!!! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2010 : 00:56:21
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Citazione:
Messaggio inserito da darkene
se vedi uno smear probabilmente ti porti dietro del DNA. centrifuga il campione al massimo dei giri per 20 min a 4°C e prendi il surnatante.
ti ripeto, carico 80-100 ug e non ho problemi di corsa. ti consiglio ti farti il gel tu, un 12-14% dovrebbe andare. sai, non mi fido tanto delle cose preconfezionate quando testo cose nuove!!!
Il problema di caricarne 80-100 ug è di ordine pratico, visto che ho concentrazioni tali che mi porterebbero a prendere volumi troppo grandi per 80-100 ug.
Ad esempio, alcuni campioni sono circa 5 ug/ul, ma la maggior parte sono più diluiti!
Comunque, indipendentemente dal migliorare le bande, quello che in ogni caso non mi spiegherò è come possibile che trovo la proteina a circa 72-55 kDa, quando invece in letteratura viene descritta di 18 kDa.
La cosa interessante è che il datasheet dell'anticorpo non riporta la classica immagine di prova con le bande visibili e l'altezza. Ed è una delle poche proteine in cui non è descritto. |
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Nuovo Western Blotting (consigli per proteine in complessi)
Didattica e Relazioni
