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GFAP
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 15 giugno 2010 : 13:19:56

Salve a tutti. Da quanto ho iniziato a fare il western, mi succede una cosa strana. Dopo il trasferimento con semi-dry uso il Ponceau per vedere le proteine in nitrocellulosa e vedo che le proteine al di sotto dei 30kDA si trasferiscono male (per male intendo senza una forma precisa e molto ondulate).
Come posso fare? E' un problema di corsa elettroforetica?

E poi un'altra curiosità visto che ho visto usare l'uno e l'altro metodo : il caricamento dei campioni del Western si fa addizionando una quantità di Laemmli 1:1 con il campione(2,5ul campione+2,5ul Laemmli) o si carica il campione addizionato ad una quantità di Laemmli in modo da ottenere un volume uguale in tutti i pozzetti (es: 2,5ul campione A e 3,0 campione B. Porto con il Laemmli ad un volume di 7ul tutti e due)

Grazie.

Neuroscience
Utente

659 Messaggi

Inserito il - 15 giugno 2010 : 13:32:26

per il primo punto dipende da una serie di cose, soprattutto dalla corsa.
1) percentuale del gel
2) Quanto lo hai fatto migrare
3) Voltaggio usato per la corsa
etc

Per il secondo punto è corretto portare i campioni a volume per avere la stessa risoluzione delle bande, però la differenza è estremamente minima dato che in tutti i pozzetti andrà a finire comunque il buffer di corsa e si porteranno comunque tutti i campioni allo stesso volume.

GFAP
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 15 giugno 2010 : 15:51:19

Grazie della risposta. Allora corro a 200v gel al 12% (ma lo fa anche al 10% all'8%). Faccio migrare fino alla fine (circa 45 minuti).