protocollo per estrazione mRNA

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Autore

Discussione

°silvia°
Nuovo Arrivato

Prov.: Genova
Città: genova

100 Messaggi

Inserito il - 24 ottobre 2006 : 11:18:50

Ciao, non riesco a trovare in rete un protocollo per l'estrazione di mRNA (eucarioti). Qualcuno può darmi una mano?
Non uso kit (per ora...) e nemmeno radioattivo..

grazie

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 24 ottobre 2006 : 18:34:04

Ciao Silvia,
ma da che materiale devi estrarre???

Comunque in genere se non usi kit si estrae con il fenolo/cloroformio.
Si utilizza prima una soluzione di lisi con tiociamato di guanidinio che lisa le cellule, denatura le proteine e inattiva le RNasi. Poi si utilizza fenolo/cloroformio acido si centrifuga e si separa la fase organica contenente DNA e proteine e la fase acquosa contenente RNA.
L’ambiente acido ti consente di avere nella fase acquosa RNA e non DNA.
questo è link per un protocollo di estrazione in cellule eucariotiche:
http://www.bbcm.units.it/~tossi/RNAextrac.htm

Attenzione! Così estrai l’RNA totale per estrarre solo l’mRNA dovresti utilizzare delle colonnine che ti legano specificamente l’mRNA (ad. es resine con oligo-dT).

Poi anche usare il reagente TRIZOL (che altro non è che il metodo di prima!!!) il trizol è composto da fenolo e isotiocianato di guanidinio, poi aggiungi il cloroformio…

Che io sappia i metodi sono questi, ma non escludo che ce ne siano altri!!!

Ah dimenticavo nella sezione protocolli del forum trovi il protocollo per l'estazione con TRIZOL da cellule eucariotiche!

http://www.molecularlab.it/protocolli/showprot.asp?cat=3

°silvia°
Nuovo Arrivato

Prov.: Genova
Città: genova

100 Messaggi

Inserito il - 25 ottobre 2006 : 17:22:09

grazie, devo estrarre da retina.
Avevo trovato dei protocolli ma non so se in lab abbiamo oligo-dT... chiederò =)

grazie!

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 26 ottobre 2006 : 00:37:41

Beh di estrazione da retina non so molto... ma guardando un po' in internet ho visto che hanno estratto usando Trizol!

Ma devi per forza isolare solo l'mRNA? In genere si estrae sempilcemente l'RNA totale.

Ciao