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MARYANGY
Nuovo Arrivato
85 Messaggi |
 Inserito il - 04 marzo 2009 : 11:56:45
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ciao ragazzi...devo fare un esame... vorrei essere spiegata molto semplicemente in cosa consiste la tecnica dige... in ke campo è applicata, e piu o meno i passaggi ke la caratterizzano. grazie a tutti!
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2009 : 17:03:44
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http://www.med.uc.edu/proteomics/dige.htm
c'è anche una figura esplicativa, vedi se ti è utile.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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MARYANGY
Nuovo Arrivato
85 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2009 : 17:35:04
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| ciao iside... senti nn avresti la stessa pagina o qualcosaltro in italiano? perche domani ho l'esame e sto un po...incasinata! grazie... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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MARYANGY
Nuovo Arrivato
85 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2009 : 18:45:14
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| si gfpina lo so solo ke x fare l'esame volevo una spiegazione semplice x capirla subito. cmq se nn ho capito male il campione si miscela con una soluzione ke fa da controllo. queste prima si colorano cn dei coloranti ke danno fluorescenza poi si uniscono i due campioni e si fa un elettroforesi. e poi si misura la fluorescenza! ditemi di si...! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2009 : 19:43:29
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Beh nella presentazione che ti ho indicato è descritto in modo semplice tutto quello che devi sapere.
Diapositive 8-9 e 11-12!!!
Non utilizzi una soluzione di controllo (dove l'hai letto???) ma confronti 2 campioni, dal nome della tecnica: DIGE = "fluorescence difference gel electrophoresis" --> vedi la differenza tra due campioni.
Un campione è marcato con un composto fluorescente (rosso), l'altro con un altro composto fluorescente (verde), li misceli e li carichi sul medesimo gel, poi fai l'elettroforesi e vai a vedere la fluorescenza.
Risultati:
spot rossi: proteine presenti solo nel campione 1
spot verdi: proteine presenti solo nel campione 2
spot gialli (rosso + verde): proteine presenti in entrambi i campioni
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MARYANGY
Nuovo Arrivato
85 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2009 : 20:00:39
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| ok pina grazie di tutto! |
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Cris87
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2009 : 11:13:05
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Ritorno sull'argomento D.I.G.E. perchè nonostante abbia consultato entrambi i link proposti mi restano alcuni dubbi:
1)a che serve lo standard interno? come si ottiene?
2)non capisco che vantaggi possa avere rispetto a una normale eletrroforesi 2D+ spettrometria di massa. Su alcune dispense che ho si dice che elimina i problemi connessi alla variabilità del gel perchè su un solo gel sono caricati due campioni...ma se io faccio elettroforesi+MS per entrambi i campioni separatamente anche così posso quantificare l'espressione delle proteine nei due campioni senza star a fare la dige.sbaglio?
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android
Nuovo Arrivato
Città: roma
41 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2009 : 14:50:19
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Citazione:
a che serve lo standard interno? come si ottiene?
Che io sappia lo standard interno non si usa, con la DIGE puoi confrontare massimo due campioni diversi...se si usasse uno standard confronteresti un solo campione con lo standard proteico a concentrazione nota per fare una quantificazione assoluta, ma non credo sia questa la tecnica migliore per farlo.
Citazione:
ma se io faccio elettroforesi+MS per entrambi i campioni separatamente anche così posso quantificare l'espressione delle proteine nei due campioni senza star a fare la dige.sbaglio?
Non sbagli...ma nemmeno cogli il vantaggio della tecnica.
Se tu con lo stesso e identico campione fai due gel 2D uno dopo l'altro, vedrai che le proteine non si separano nello stesso e identico modo, quindi i 2 profili di centinaia/migliaia di spot proteici non saranno confrontabili al 100%.
Questo perchè esiste un problema di RIPRODUCIBILITA' della tecnica gel 2D.
La DIGE ti offre la possibilità di fare la separazione e la quantificazione relativa delle proteine presenti in due campioni diversi, facendo un solo gel 2D e quindi abbattendo il problema della riproducibilità.
Questo però solo per due campioni!! Esistono Tecniche che ti permettono di confrontarne fino a otto contemporaneamente (ad es. l'iTRAQ), ma non usano gel 2D.
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"il risultato può essere casuale, la prestazione no" |
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Cris87
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2009 : 17:11:50
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Citazione:
Che io sappia lo standard interno non si usa, con la DIGE puoi confrontare massimo due campioni diversi...se si usasse uno standard confronteresti un solo campione con lo standard proteico a concentrazione nota per fare una quantificazione assoluta, ma non credo sia questa la tecnica migliore per farlo.
No purtroppo sono certo al 110% che lo standard interno si usa...c'è scritto su alcune dispense che ho e anche su alcuni documenti che ho trovato su internet.Ma non capisco a che serve...se qualcuno lo sa lo prego di scriverlo.
Citazione:
Non sbagli...ma nemmeno cogli il vantaggio della tecnica.
Se tu con lo stesso e identico campione fai due gel 2D uno dopo l'altro, vedrai che le proteine non si separano nello stesso e identico modo, quindi i 2 profili di centinaia/migliaia di spot proteici non saranno confrontabili al 100%.
Questo perchè esiste un problema di RIPRODUCIBILITA' della tecnica gel 2D.
La DIGE ti offre la possibilità di fare la separazione e la quantificazione relativa delle proteine presenti in due campioni diversi, facendo un solo gel 2D e quindi abbattendo il problema della riproducibilità.
Questo però solo per due campioni!! Esistono Tecniche che ti permettono di confrontarne fino a otto contemporaneamente (ad es. l'iTRAQ), ma non usano gel 2D.
Ok però questo problema di riproducibilità in cosa consisterebbe? è legato alle proprietà chimico-fisiche del gel? è dovuto a variazioni microscopiche del campo elettrico applicato? A cosa è dovuto??
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android
Nuovo Arrivato
Città: roma
41 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2009 : 21:04:55
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Non metto in dubbio che lo abbia letto. Magari nelle dispense si fa riferimento al controllo nel senso di campione di controllo (ad es. faccio analisi quantitativa di un campione malato rispetto ad un controllo sano). In questo caso fai una quantificazione relativa direttamente sul gel ed usi la MS solo per l'identificazione.
Se poi sei sicuro che per controllo si intende proteine standard di riferimento a concentrazione nota, vuol dire che si può usare la DIGE per fare quantificazione assoluta. Che in linea di principio è possibile, ma solitamente gli standard si usano per fare quantificazioni assolute su alcune proteine bersaglio direttamente in MS e non su gel.
Comunque se vuoi mettere un link di qualche documento che hai letto ci do un'occhiata volentieri perchè risulta interessante anche per me.
Citazione:
Ok però questo problema di riproducibilità in cosa consisterebbe? è legato alle proprietà chimico-fisiche del gel? è dovuto a variazioni microscopiche del campo elettrico applicato? A cosa è dovuto??
volevo sottolineare che le variazioni da gel a gel non sono macroscopiche, ma creano lo stesso problemi a causa dell'estrema complessità dei campioni in questione.
Considera che solitamente ottieni migliaia di spot (la maggior parte a bassa intensità), quindi anche piccoli shift di migrazione possono complicare parecchio una situazione già complicata in partenza.
Comunque direi che la riproducibilità è influenzata da un insieme di fattori(tipo di strip IEF, metodo di colorazione, variazioni del campo elettrico etc...) |
"il risultato può essere casuale, la prestazione no" |
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Cris87
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2009 : 11:59:20
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Grazie per le risposte : il "problema" della riproducibilità del gel è risolto. 
Per quanto concerne invece il discorso sullo standard interno,riferimenti a tale standard sono presenti anche nel link messo da Iside ossia questo http://www.med.uc.edu/proteomics/dige.htm.
Se hai 5 minuti per darci un'occhiata mi fai un grosso favore. |
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android
Nuovo Arrivato
Città: roma
41 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2009 : 23:22:22
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Ok, mistero svelato...o almeno credo!!
Io ero rimasto al DIGE a due fluorofori...invece si fa anche con tre.
lo standard interno non è niente altro che il pool dei campioni che vuoi confrontare e serve per normalizzare le variazioni del segnale fluorescente da gel a gel quando vuoi analizzare più di 3 campioni.
Essendo una miscela di tutti i campioni quindi contiene tutte le proteine.
dai un'occhiata qui, pagina 6 e 7 :
http://www.cgm.ntu.edu.tw/ppc/resource/1015-2007DIGE_DeCyder.pdf
è abbastanza chiaro
ciao! |
"il risultato può essere casuale, la prestazione no" |
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Cris87
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2009 : 12:12:15
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Ok grazie mille  |
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doraemon
Nuovo Arrivato
37 Messaggi |
 Inserito il - 28 settembre 2010 : 20:30:05
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sempre sull'argomento DIGE..su un articolo ho letto che una delle sue limitazioni è l'impossibilità di tagliare direttamente gli spot per l'analisi alla spettrometria di massa senza tecniche di post-colorazione.. sapreste dirmi perchè?
grazie tante  |
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tecniche dige
Didattica e Relazioni
