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1969rc
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
 Inserito il - 06 dicembre 2010 : 16:28:10
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Cari tutti,
vi vorrei sottoporre un problema che mi perseguita da un po' di tempo ovvero la compatibilità tra la tecnica ELISA e la solubilizzazione delle proteine in SDS. In pratica io ho seguito un protocollo di estrazione di proteine da tessuto che nel passaggio finale mi fa solubilizzare le mie proteine in SDS 1%. Fin qui tutto bene se non che la tecnica che io voglio usare non è il western-blot ma l'ELISA e non riesco a capire se la solubilizzazione in SDS è compatibile con questo approccio. Qualcuno mi potrebbe chiarire questo dubbio?
Grazie
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2010 : 18:54:08
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l SDS ovviamente nel WB è importante per la migrazione proteica nel gel...ma ovviam nell'ELISA questo a te non serve!
l SDS alla fine è un detergente anionico, che oltre ad aiutare la linearizzazione delle proteine e conferirgli un carica netta - non fa nulla di che...
io credo quindi che non influisca..ma nel dubbio magari solubilizza le proteine in RIPA!
ciao |
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1969rc
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2010 : 10:15:12
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Mille grazie per il tuo suggerimento tuttavia il mio problema è che ho già tutti i miei campioni solubilizzati in SDS 1% e quindi per il futuro seguirò sicuramente il tuo consiglio ma per ora devo riuscire a capire bene come muovermi per non spendere dei soldi inutilmente. Infatti in rete ho trovato dei kit in grado di togliere i detergenti in cui sono solubilizzate le proteine, tuttavia anche qui mi sorgono un po' di questioni. Infatti come mi hai ricordato tu l'SDS è in grado di denaturare la mia proteina e di renderla una semplice catena polipeptidica lineare e infine anche di caricarla negativamente. Tralasciando la carica, se il mio problema con l'ELISA è la denaturazione (infatti ho letto un po' in giro che la denaturazione potrebbe non permettere più il riconoscimento dell'anticorpo per uno specifico epitopo) non credo che lo risolverei togliendo dai miei campioni l'SDS, perchè non credo che una volta senza SDS la mia proteina da semplice catena polipetidica lineare sia in grado di ripiegarsi e tornare allo stato naturale; o mi sbaglio? Inoltre: ammettendo che la denaturazione proteica non centri nulla con l'interazione anticorpo proteina, l'altro problema che mi pongo è se l'SDS presente nel mio campione invece è in grado di denaturare anche gli anticorpi presenti nel kit ELISA, allora si che togliere l'SDS potrebbe essere una soluzione.
Saluti |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2010 : 10:29:47
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innanzi tutto bisogna vedere se l'epitopo che riconosce l' Ig è lineare o no (ossia composto da porzioni non consecutive della catena proteica). se il tuo è il primo caso, allora non dovresti aver problemi, se invece è il secondo allora è importante mantenere le strutture secondarie e terziarie.
detto ciò, non credo sia impossibile far riacquistare alla proteina la sua conformazione una volta tolto l SDS, anke perchè bisogna ricordare che la proteina assume quasi spontaneamente la conformazione energeticamente più favorevole (cioè con minore dG).
per l Ig invece non mi preoccuperei, non credo che l SDS faccia nulla...anke perchè è all 1%...
ciaoooooo |
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1969rc
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2010 : 10:50:57
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Grazie molte per i tuoi consigli e a buon rendere.
Saluti |
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Alessia
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
59 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2010 : 16:34:16
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| ciao. fossi in te non utilizzerei SDS in quanto sia l'anticorpo 1 che secondario utilizzati nell'elisa riconoscono epitopi della proteina foldata e nn linearizzata quindi rischieresti di leggere aspecifico. ne sono abbastanza sicura in quanto io faccio elisa da estratto di tessuto e non poche volte mi dava dei valori altissimi poi verificatesi falsi. inoltre gia che ci sono se proprio devi fare elisa su tessuto utilizza solo ed esclusivamente quantikine r&d in quanto gli altri (in cui fai tu il coating) danno spesso questi problemi di specificità. te lo dico con sicurezza non perchè l'ho letto da qualche parte ma perchè ho fatto moltissime elisa e dall'esperienza ho imparato. infatti esistono pochissimi kit esclusivi per tessuto gli altri sono prevalentemente per sovranatanti e siero. ciaoo |
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ELISA SDS
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