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karenina
Utente Junior



131 Messaggi
Inserito il - 04 aprile 2009 : 21:34:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di karenina Invia a karenina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao ho bisogno di aiuto.
in una quantificazione di rna per fare una real time..devo farmi una retta di taratura giusto?
allora come devo regolarmi su quanti punti fare la retta ? COME FACCIO a regolarmi per sapere a qaunto devo diluire il mio rna?
e poi per avere la concentrazione finale posso semplicemente usare la costante di proporzionalità ? ma poi la cosatnte di proporzionalità la devo ottenere dalla media delle costanti di tutti i punti?

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi
Inserito il - 05 aprile 2009 : 00:31:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hmmmm... e cosa c'entra bradford?

Ad ogni modo fai una regressione lineare, vedi:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1378
(si parla di enzimi ma l'idea è la stessa)
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 05 aprile 2009 : 09:54:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
di solito l'RNA si legge allo spettrofotometro!
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karenina
Utente Junior



131 Messaggi
Inserito il - 05 aprile 2009 : 11:33:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di karenina Invia a karenina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si ok lo so che si legge allo spettrofotometro... ma scusa non si usa la legge lambert beer? non si fa la retta di regressione?
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karenina
Utente Junior



131 Messaggi
Inserito il - 05 aprile 2009 : 11:36:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di karenina Invia a karenina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ah no vabbè sucsate mi sono confusa con i nomi... bradford è per le proteine intendevo...lambert beer
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 05 aprile 2009 : 12:12:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Semplicemente lo leggi allo spettrofotometro e dal valore di densità ottica ottenuto mediante la legge di Lambert-Beer ricavi la concentrazione. Non serve fare nessuna retta.
Guarda ad es qua: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=3199
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karenina
Utente Junior



131 Messaggi
Inserito il - 05 aprile 2009 : 12:57:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di karenina Invia a karenina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ah si?' non serve insomma tarare lo strumento.. boh vabbèm aperchè si usa 40 per rna' e che diluizione devo usare?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 05 aprile 2009 : 13:37:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da karenina

ah si?' non serve insomma tarare lo strumento..

La taratura dello strimento si fa leggendo prima il "bianco", cioè la soluzione in cui è diluito il tuo campione.
Poi bisogns vedere che spettrofotometro hai, se azzera automaticamente l'assordamza dopo avel letto il bianco e se invece devi segnarti il valore e sottrarlo da quello del tuo campione.
Qua trovi una discussione in proposito: quantificazione mediante spettrofotometro

Citazione:
perchè si usa 40 per rna
E' il coefficiente di estinzione molare medio per l'RNA, sono valori calcolati sperimentalmente!
1A260 = 40 µg/ml RNA

Citazione:
che diluizione devo usare

dipende da quanto è grande la tua cuvetta e da quanto è concentrato il campione, io in genere uso 1:100 - 1:50 ho delle cuette dove posso mettere anche solo 50ul, quindi spreco solo 1ul di campione.
Ma anche di questo si parla nella discussione che ti ho indicato.
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angemore
Nuovo Arrivato



82 Messaggi
Inserito il - 05 aprile 2009 : 14:21:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di angemore Invia a angemore un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mi raccomando...usa cuvette al quarzo quando leggi gli acidi nucleici...
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi
Inserito il - 05 aprile 2009 : 18:45:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Puoi anche usare le UVette della Eppendorf, che sono di un materiale plastico fatto apposta
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 05 aprile 2009 : 18:55:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da chick80

Puoi anche usare le UVette della Eppendorf, che sono di un materiale plastico fatto apposta

a tal proposito, ho ritrovato questa: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1715
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