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madferit84
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11 Messaggi |
 Inserito il - 26 aprile 2009 : 00:42:09
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ciao ragazzi allora mi e` venuto un dubbio e volevo discuterne con voi.
dunque sono impegnato nel clonaggio e sequenziamento del gene mc1r coinvolto nelle pathways che giocano un ruolo fondamentale nell`insorgere del Melanoma. vi riassumo i passi fatti:
1) amplificazione by PCR della coding region con primer disegnati x poter clonare il gene usando pENTR Directional TOPO cloning by invitrogen tramite DREAMTAQ GREEN POLYMERASE BY FERMENTAS ( non e` proof reading in quanto con la pfx abbiamo avuto groooosi problemi)
2)subcloning in t easy vector 2 by Promega
3) ecori digestion
4) purificazione gel dell` mc1r generato dalla digestione e topo CLONING
....e la faccenda continua....usando la tecnologia GATEWAy....
ora x clonare in TOPO un requisito fondamentale e` la presenza di prodotto PCR BLUNT ended! la dreamtaq green none` proof reading quindi genera sticky ends . x questo motivo decidemmo di procedere prima al sub-cloning in teasy...tagliare il gene di interesse dal plasmide con ECORI e clonarlo in topo.
lamia domanda e`: se ecori e` un endonucleasi...genera ancora una volta sticky ends....?? siamo riusciti aclonare il gene il topo..quindi presumo di avere pcr product blunt end!?
che ne pensate?
2)
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