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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 12 giugno 2005 : 00:28:57
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In laboratorio abbiamo fatto un esperimento di trasformazione di cellule di E. Coli mutate nel gene LacZ con plasmidi pBTAC.
Alcuni di questi plasmidi avevano integrato il gene PhoC grazie ad un sito unico di clonaggio a livello dell'alfa-peptide della beta-galattosidasi.
Di conseguenza, fornendo il cromogeno X-gal e IPTG come induttore, si potevano osservare colonie blu (nelle quali l'alfa peptide non era interrotto) e colonie bianche (nelle quali l'alfa peptide era interrotto a causa del gene PhoC).
Fin qui tutto bene. Abbiamo poi voluto osservare l'espressione di PhoC. Abbiamo inoculato una colonia bianca in un terreno liquido da noi preparato e lasciato crescere. Poi abbiamo centrifugato 1ml di coltura e risospeso il pellet con un tampone. Qui arriva la prima domanda: perchè abbiamo centrifugato?
Dopodichè, abbiamo aggiunto un substrato della fosfatasi (codificata da PhoC), il para-nitro-fenil-fosfato. E qui giunge il secondo dubbio: dalla reazione operata dalla fosfatasi, si dovrebbe ottenere PDP (fenolftaleinadifosfato) e verde metile (o qualcosa del genere), che colora di verde il terreno. (la reazione non mi è ben chiara...)
Poi, per bloccare la reazione, aggiungiamo NaOH che porta ad una colorazione gialla, la quale, mediante spettrofotometro, ci permette di risalire alla concentrazione della fosfatasi.
Qualcuno ne sa qualcosa di più?
Grazie!
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 12 giugno 2005 : 11:01:43
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In generale quando lavori con delle cellule in sospensione, prima di usarle le centrifughi sempre per eliminare il terreno di coltura "vecchio" che può contenere sostanze interferenti con la successiva lettura (ad es. cellule morte potrebbero aver rilasciato fosfatasi nel terreno o magari semplicemente il terreno è giallo e interferisce con la lettura finale). Inoltre risospendendo le cellule puoi usare un volume più piccolo che magari è più comodo.
Per quanto riguarda la reazione della fosfatasi sinceramente non la conosco, però ho trovato questo:
PhoC reporter assays.
The M. morganii PhoC phosphatase activity using p-nitrophenyl phosphate (pNPP) as a substrate was assayed by measuring the released p-nitrophenol at 414 nm at pH 12. After growth in liquid medium, a number of cells corresponding to an OD600 of 1 were centrifuged and the pellet was resuspended in 50 µl sterile H2O with the addition of 10 µl 0·5 M EDTA to inhibit E. coli phosphatases. After 15 min at room temperature, 50 µl 2 M sodium acetate, 50 µl 100 mM pNPP and 840 µl H2O were added to the cell suspension and incubated at 37 °C for 30 min. The reaction was stopped by adding 2 ml 2 M NaOH and absorbance of the samples was measured at 414 nm. The PhoC enzymic activity was assayed also on plates of TPMG (Tryptose phosphate/phenolphthalein/methyl green) indicator medium containing Tryptose-phosphate agar (Difco) pH 7·2, supplemented with 1 mg phenolphthalein diphosphate ml1 (tetrasodium salt; Sigma) and 50 µg methyl green ml1 (Sigma). Colonies producing PhoC develop a green colour after incubation at 37 °C overnight.
Quindi sembra che il paranitrofenilfosfato sia idrolizzato in paranitrofenolo e fosfato (in effetti una fosfatasi non può fare che questo). Puoi misurare l'attività andando a vedere quanto paranitrofenolo c'è (abs a 414nm).
La colorazione verde invece è un altro test, che deriva dall'uso di terreno addizionato di TPMG che sarà un complesso che idrolizzato diventa verde.
Insomma dovrebbero essere 2 test separati se non ho capito male!
Ciao!
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2005 : 13:44:19
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Ti ringrazio molto per la risposta!
La seconda parte, in effetti, sembrerebbe consistere in due test separati, anche se ce li hanno raccontati insieme... |
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