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Messaggio inserito da scatterbrain

ciao a tutti!
sono alle prime armi nel tirocinio, oggi ho assistito alla preparazione dei vetrini per immunofluorescenza su sezioni di tessuto e non mi sono chiari acluni passaggi, vi scrivo il protocollo che abbiamo utilizzato mettendo i miei dubbi tra parentesi:
- discesa con vari alcool (100 D, 95 D ecc.)si chiama idratazione- sciacquo con H2O distillata

- PBS + Triton (per quanti minuti?)Dipende dallo spessore della fetta... bastano anche 10/15 min

- anticorpi primari in concentrazione 1 a 50 (cioè 1 microlitro ogni 50 microlitri di PBS + Triton, giusto? mi sembra che il prof abbia utilizzato il PBS (sempre + triton) in cui erano stati precedentemente immersi i vetrini, è possibile o mi inganna la memoria..? poi, anche in questo caso come per l'anticorpo secondario si utilizza il siero di capra, giusto?) il triton serve principalmente per permeabilizzare per quello avete fatto prima l'incubazione con la soluzione PBS+triton. Di solito non si usa durante l'incubazione con gli ab... però nessuno vieta di mettercelo, magari a concentrazioni minori, per permeabilizzare ulteriormente (...io mai fatto). Il siero serve per bloccare l'aspecifico... e di solito si fa un incubazione di un ora circa prima d mettere il primario. Quando hai un ab che ti crea molto aspecifico puoi aggiungere anche in questa sede il siero per bloccarlo.
- 3 sciacqui con pbs + triton (non mi ricordo se poi li ha sciacquati in H2O distillata?)
No nn credo sia passato dall'H2O distillata...avrà usato solo il buffer... in questa sede il triton (ad un concentrazione minore rispetto a quella usata nella prima incubazione)serve per "lavare via" tutto ciò che non si è legato... così avrai una reazione più pulita. (Ci sono molte scuole di pensiero su questo passaggio....)

- anticorpo secondario (con pbs + triton e siero di capra)
- tot ml di H2O distillata con colorante, acqua ossigenata (perché nell'anticorpo secondario è presenta perossidasi)e una goccia di un altro composto che purtroppo non ricordo forse hai fatto un immunoistochimica... non un immunofluo... e quello che hai visto è lo sviluppo con la DAB o simili.



purtroppo sono riuscita a prendere pochi appunti perché alcune cose ho dovuto farle io e non potevo scrivere :(

grazie in anticipo a chi mi risponderà!

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