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 Inserito il - 20 marzo 2020 : 19:42:14
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Riporto un esempio, purtroppo certe cose se non le vedi in laboratorio sono difficili da capire...dopo aver estratto e purificato l'RNA ho una miscela di tutti gli RNA se volessi solo gli mRNA utilizzo una cromatografia di affinità sfruttando il fatto che i messaggeri hanno estremità 3' poliA.
A questo punto ho la mia miscela di TUTTI i messaggeri di un dato tessuto in un dato momento.
Faccio il dosaggio dell'RNA con spettrofotometro e calcolo la concentrazione, e valuto la purezza del mio campione (Supponiamo sia tutto ok).
Carico la stessa quantità in mg nei pozzetti di ogni corsa, faccio la corsa in gel di agarosio in condizioni denaturanti e trasferisco su memebrana. A questo punto supponiamo che ho la sonda radioattiva per i messaggeri della Discherina e la sonda radioattiva per i messaggeri di actina (controllo interno per la normalizzazione)
Domande
Dal gel alla membrana di nitrocellulosa avviene il trasferimento di TUTTI i messaggeri che ho purificato e corso su gel, ma visualizzo solo la banda relativa ai messaggeri di discherina e la banda relativa ai messaggeri di actina perché ho usato le sonde specifiche per questi due tipi di messaggeri?
Se ad esempio applicassi un'altra sonda per un altro "tipo" di messaggeri (relativo alla proteina X) visualizzerei anche un'altra banda? Altra cosa...dall'immagine mostra come se le sonde fossero state applicate sulla stessa membrana di nitrocellulosa, mi domando si preparano due membrane diverse oppure è la stessa membrana che viene prima incubata con una sonda (ad esempio quella per i messaggeri relativi alla discherina) e poi incubata con l altra sonda (quella per i messaggeri relativi all'actina)?
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Scat
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Inserito il - 20 marzo 2020 : 19:44:52
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Domande relative all'immagine. N, tessuto normale e T, tessuto tumorale.
Nel primo rettangolo da sinistra leggendo in verticale, posso notare che nel tessuto normale la discherina è espressa 10 e l'actina è espressa 10. Nel tessuto tumorale l'actina è espressa 10 come da letteratura (sono esempi) mentre la discherina è espressa 5 e in questo caso il mio esperimento è valido penso.
Nel secondo rettangolo nel tessuto normale è espressa 10 l'actina e la discherina ma nel tumorale sia l'actina che la discherina è 5, in questo caso potrebbe essere che l'operatore ha sbagliato a caricare il campione nel pozzetto relativo al tessuto T? penso non dovrebbero esserci errori dovuti al dosaggio allo spettrofotometro o alla RNasi che degrada il campione. cioè io immagino come se avessi due eppendorf una per il campione N e una per il campione T dove ho tutti i messaggeri se ho estratto bene e ho fatto il dosaggio bene l'unica cosa può essere il caricamento insomma mi sembra troppo omogeneo come errore per essere relativo a dosaggio o RNasi.
nel rettangolo di sinistra anche qui si può ipotizzare che nella line T abbia sbagliato il caricamento...sembra quasi un errore che si porta dietro in modo omogeneo, tanto è vero io qui potrei dire che la discherina nel tumore si over esprime. |
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