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Nastenka
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 Inserito il - 24 luglio 2009 : 14:51:29
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Ciao gente!
Avrei bisogno di un pò di informazioni sul binding recettoriale, nelle tecniche usate in neuroscienze.
Vi ringrazio e buona serata!
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-maddy-
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Città: cagliari-torino
50 Messaggi |
Inserito il - 24 luglio 2009 : 21:49:56
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ciao!
La metodica del binding recettoriale è una tecnica biochimica che permette di stabilire, con l’impiego di radioisotopi, se una determinata preparazione tissutale presenta dei siti di riconoscimento specifici per il ligando utilizzato e, in secondo luogo, determinare le caratteristiche di legame (costante di affinità, densità recettoriale, costanti di cinetica della reazione).
Quando si parla di recettore bisogna fare riferimento al sistema effettore al quale il recettore è accoppiato. Questo sistema può essere un enzima, come l'adenilato ciclasi e la tirosina chinasi, o un canale ionico.
Il legame (binding) di un agonista al recettore attiva il sistema effettore e provoca una risposta biologica, mentre gli antagonisti o bloccanti inibiscono le azioni degli agonisti. La sequenza di eventi che implicano l'azione recettoriale può essere divisa in tappe:
1. Occupazione del recettore da parte della molecola agonista. Questa tappa è regolata strettamente dalla possibilità di diffusione del ligando dal luogo della sua liberazione al recettore.
2. Accoppiamento tra recettore e sistema effettore per la risposta biochimica primaria.
3. Attivazione di eventi biochimici intracellulari che eventualmente conducono alla risposta fisiologica finale della cellula bersaglio.
4. Desensitizzazione e/o down regulation del recettore. Questi fenomeni sono responsabili della diminuita risposta del recettore in seguito alla continuata occupazione del recettore da parte del ligando.
Quindi, attraverso l'impiego di ormoni o farmaci marcati, è possibile determinare la densità dei recettori (oltre che l'affinità dell'ormone o del farmaco per il proprio recettore) sulle cellule bersaglio o su frazioni subcellulari (membrane esterne, mitocondri, reticolo sarcoplasmatico, ecc.).
Criteri di specificità per i siti recettoriali
Occorre fare una distinzione tra recettore e binding site: un recettore è un sito di competizione per l'agonista e l'antagonista e lo stimolo prodotto dall'agonista porta ad una risposta fisiologica. Al contrario un binding site è solo un sito accettore a cui non è necessariamente connessa la trasmissione di un segnale e quindi una risposta fisiologica. Per poter parlare di recettore vero e proprio occorre quindi che siano soddisfatti certi criteri. Questi criteri sono riportati di seguito:
1. Correlazione tra affinità del farmaco in vitro e potenza farmacologica in vivo.
2. Distribuzione regionale o specificità tissutale.
3. Stereospecificità.
4. Saturabilità.
5. Reversibilità.
6. Alta affinità.
7. Competizione con agonisti o antagonisti appartenenti a classi chimi che e farmacologi che diverse.
Solo quando questi punti sono soddisfatti possiamo definire un binding site come “receptor site”. La misura biochimica del binding di un ligando ai binding sites è divenuta una pratica comune grazie alla sempre maggiore disponibilità commerciale di molecole marcate. La concentrazione di recettori (o binding sites) nella maggior parte dei tessuti è nel range di femtomoli o picomoli per milligrammo di tessuto umido, che significa una concentrazione di recettori di 1x10-12 – 1x10-9M o leggermente più alta (1x10-8 M). Come conseguenza di queste concentrazioni è necessario avere tecniche di binding che impieghino ligandi con le seguenti caratteristiche:
1. alta affinità (cioè la costante di dissociazione del complesso ligando-recettore deve essere nel range della concentrazione recettoriale)
2. alta selettività (il ligando deve legarsi ad un solo tipo di recettore e legarsi il meno possibile alle componenti non recettoriali della membrana)
3. alta attività specifica (rappresenta la quantità di radioattività presente in una data unità molare del composto).
Questa ultima caratteristica risulta essere molto importante in quanto, utilizzando un radioligando con una elevata attività specifica, possiamo rilevare delle concentrazioni di isotopo molto basse e quindi siamo in grado di misurare la densità di un recettore anche in un tessuto in cui si trova ad una concentrazione relativamente bassa.
Gli isotopi più comunemente utilizzati nella metodica del binding sono il trizio (3H) e lo Iodio 125 (125I), mentre vengono utilizzati meno frequentemente il carbonio 14 (14C) e lo zolfo 35 (35S). L’utilizzo degli isotopi triziati è il più comune in quanto si tratta di composti stabili e ad alta attività specifica che conservano la stessa attività biologica posseduta dai corrispondenti composti non marcati.
Il principio fondamentale della tecnica del binding recettoriale consiste nell’incubazione dell’omogenato di tessuto, opportunamente diluito e di cui si dovrà determinare la concentrazione proteica, con un ligando radioattivo. L’incubazione deve essere eseguita ad una temperatura e per una durata di tempo ottimali, che sono caratteristici per il tipo di recettore preso in esame e il tipo di radioligando utilizzato. L’incubazione avviene in presenza (legame non specifico) e in assenza (legame totale) di un eccesso di composto non marcato, che compete con il ligando radioattivo per il sito recettoriale in esame: questa procedura si rende necessaria in quanto le sostanze radioattive si legano non solo al loro sito specifico, ma anche ad altre strutture cellulari in modo non specifico. L’aggiunta al mezzo di incubazione di un agente competitivo non marcato (spiazzante) in elevata concentrazione (100-1000 volte la Kd del recettore) permette di valutare la radioattività legata in modo non specifico alle membrane tissutali e, per differenza dal legame totale (determinato in assenza dell’agente competitivo), consente di valutare il legame specifico.
Durante l’incubazione ha luogo la formazione del complesso ligando-recettore, che segue la legge d’azione di massa e pertanto può essere rappresentata come segue:
K1
[L] + [R] [LR]
K2
dove:
L = ormone o il ligando radiomercato
R = recettore
LR = complesso ligando-recettore
K1 = costante di velocità di associazione [L] [R]
K2 è la costante di velocità di dissociazione del complesso [LR].
Tale reazione raggiunge, dopo un periodo di tempo variabile da pochi minuti a qualche ora (periodo di incubazione), la fase di equilibrio (steady-state) in cui il binding specifico raggiunge il suo massimo: il tempo necessario per arrivare allo steady-state è ovviamente in funzione della velocità di associazione e dissociazione del complesso ligando-recettore.
Al momento dell’equilibrio si avrà:
K1[L][R]= K2[RL]
K2/K1=[L][R] (1/[RL]) = Kd
Kd è definita come la costante di dissociazione all’equilibrio, il cui valore esprime in maniera inversa l’affinità del recettore R per il ligando L (affinità = -log Kd, all’equilibrio) e rappresenta la concentrazione di un ligando che occupa il 50% dei recettori totali al momento dell’equilibrio della reazione.
Per determinare la quantità di complesso radioligando-recettore formatasi all’equilibrio, è necessario terminare l’incubazione con una procedura che permetta di separare il ligando legato al recettore dal ligando libero presente nel mezzo di incubazione: questo passaggio deve avvenire ad una temperatura inferiore o uguale a quella di incubazione in quanto le velocità di associazione e dissociazione del complesso sono dipendenti dalla temperatura. I metodi più utilizzati per terminare la reazione di binding sono:
1. Filtrazione
Consiste nel filtrare il mezzo di incubazione contenente il complesso [LR] e [L] in eccesso, sotto vuoto attraverso filtri, generalmente di fibra di vetro, su cui si deposita il tessuto con il ligando legato ai recettori. Prima della filtrazione si dispensa il tampone freddo nel mezzo d’incubazione, quindi si effettua un ulteriore lavaggio che ha lo scopo di allontanare dai filtri la radioattività non legata; il tutto viene eseguito utilizzando il tampone freddo, per bloccare la reazione e rallentare la velocità di dissociazione del complesso ligando-recettore (lo strumento utilizzato per tale procedura è illustrato in figura 1) .
Questo processo di filtrazione è indicato nello studio dei recettori che presentano una alta affinità, cioè una Kd #61603; 10 nM in quanto durante la fase di lavaggio può essere persa una certa quota del complesso ligando-recettore.
2. Centrifugazione
Il medium di incubazione viene centrifugato ad alta velocità e successivamente il pellet così ottenuto viene lavato con tampone o acqua distillata fredda solo superficialmente e senza che esso venga risospeso. Questo metodo non è molto utilizzato perché il pellet trattiene una parte del ligando libero, nonostante il lavaggio e di conseguenza il valore del binding aspecifico è alto.
Questa procedura viene generalmente utilizzata in presenza di recettori che presentano una bassa affinità (Kd #8805; 100nM).
3. Dialisi
Questo metodo, sebbene sia un metodo molto appropriato dal punto di vista teorico, può provocare una degradazione sia del recettore che del ligando. Altri problemi di aspecificità sono poi dovuti al legame del ligando con le membrane dializzatrici.
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-maddy-
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Inserito il - 24 luglio 2009 : 21:53:07
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Al termine dell’esperimento, la radioattività (complesso radioligando-recettore) legata ai filtri o presente nel pellet viene quantificata mediante spettrofotometria in liquido scintillante. Occorre naturalmente verificare sempre la quantità di radioattività che può essersi legata in maniera aspecifica ai filtri o ai tubi utilizzati nella centrifugazione.
I dati ottenuti negli esperimenti di binding devono essere elaborati matematicamente e graficamente per poter ricavare i valori dei parametri che definiscono le caratteristiche di legame di un radioligando al suo recettore, cioè la costante di affinità (Kd), la densità recettoriale (Bmax) e le costanti di cinetica relative alla velocità di associazione e dissociazione del complesso ligando-recettore.
Il saggio del binding può essere condotto con protocolli differenti e in esso si possono distinguere tre diversi tipi di studi:
1. esperimenti di saturazione, in cui viene determinato [LR] al momento dell’equilibrio della reazione;
2. esperimenti di inibizione, in cui [LR] è determinato in relazione all’aumento della concentrazione del ligando non marcato;
3. esperimenti di cinetica, in cui [LR] è determinato in funzione del tempo.
...se ti servono info su questi 3 tipi di studi, chiedi pure! maddy |
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-maddy-
Nuovo Arrivato
Città: cagliari-torino
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Inserito il - 24 luglio 2009 : 21:54:43
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hihihi...ooops ho scritto "radiomercato" anzichè "marcato"...sorry |
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Nastenka
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19 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2009 : 12:42:48
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Maddy,
non so come ringraziarti, sei stata preziosissima!
Ho letto, adesso stampo e rileggo bene...grazie infinitissime volte!!
Un'ultima cosa: hai qualche protocollo? Così mi faccio un'idea della metodica! In ogni caso, grazie ancora!!!  |
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-maddy-
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Città: cagliari-torino
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Inserito il - 28 luglio 2009 : 21:46:17
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questo è 1 esempio di binding di saturazione:
[3H]PK 11195 binding
Il binding del [3H]PK 11195 è stato determinato nella corteccia cerebrale.
Dopo il sacrificio, la corteccia cerebrale è stata rapidamente dissezionata e freezata immediatamente a –80°C. Il giorno dell’esperimento i tessuti sono stati scongelati e omogenati in 50 volumi di tampone salino fosfato di Dulbecco PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, KH2PO4 1.8 mM, Na2HPO4 10.1 mM; pH 7.4) con un polytron PT 10 (velocità 5, per 20 secondi) e centrifugati per 30 minuti a 48.000 x g a 4°C. Il pellet risultante è stato risospeso in 50 volumi dello stesso tampone e ricentrifugato sempre per 30 minuti a 48.000 x g a 4°C e, infine, il pellet è stato sospeso in 20 volumi di PBS per il saggio. Il binding del [3H]PK11195 è stato determinato in un volume finale di 500 microl, costituito da: 50 #61549;l di sospensione di membrane (contenente 150-200 microg di proteine), 50 microl di [3H]PK11195 (New England Nuclear, attività specifica 75 Ci/mmol) e tampone PBS in quantità tale da raggiungere un volume finale di 0.5 ml. Il binding non specifico è stato determinato in presenza di PK11195 10 microM non radioattivo.
L’incubazione (25°C), iniziata con l’aggiunta del tessuto, è stata bloccata 90 minuti dopo tramite filtrazione attraverso filtri in fibra di vetro (Whatman GF/B), utilizzando un apparecchio “Cell Harvester” (M-24 Brandel); i filtri in fibra di vetro sono stati precedentemente immersi in una soluzione di polietileneimmina (PEI) allo 0.1% allo scopo di ridurre al minimo il legame del radioattivo non specifico al filtro. I filtri sono stati lavati 2 volte con 4 ml di tampone PBS ghiacciato e trasferiti nei picovials contenenti 3.5 ml di liquido scintillante (Atomlight, New England Nuclear). La radioattività è stata misurata con un #61538;-counter.
Gli esperimenti di saturazione sono stati determinati incubando le membrane con sette diverse concentrazioni di [3H]PK 11195 (da 0.25 a 16 nM).
I dati ottenuti costruendo la curva di saturazione del [3H]PK 11195 sono stati analizzati col metodo di linearizzazione di Scatchard con cui è possibile estrapolare il valore della densità massima dei recettori presenti nel tessuto (Bmax) espresso in fmol/mg di proteine e la costante di dissociazione (KD) espressa in concentrazione nM (rappresenta l’affinità del [3H]PK 11195 per il suo recettore).
Le proteine sono state determinate secondo il metodo di Lowry, utilizzando il siero di albumina come standard (Lowry et al., 1951).
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-maddy-
Nuovo Arrivato
Città: cagliari-torino
50 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2009 : 22:04:37
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...cmq per riordinarti le idee ti conviene farti 1 schemino con i vari passaggi, tipo:
1)preparazione tessuto:
- omogeneizzazione e centrifugazione;
- sospensione del tessuto in opportune soluzioni tampone (per purificare maggiormente la preparazione tissutale, liberando l’omogenato da quelle sostanze endogene che potrebbero interferire con il recettore in esame)
- le soluzioni tampone con cui viene preparato l’omogenato fino alla sua forma finale sono diverse e con un diverso pH a seconda della metodica utilizzata e del tipo di recettore studiato
2)determinazione della concentrazione proteica:
incubazione (tempo e temperat ottimali). il legame specifico sarà dato da: (legame totale)-(legame aspecifico)
3) DETERMINAZIONE DELLA QUANTITÀ DI [LR] ALL’EQUILIBRIO:
separazione [LR] - [L]
4)FILTRAZIONE
(Consiste nel filtrare il mezzo di incubazione contenente il complesso [LR] e [L] in eccesso, sotto vuoto attraverso filtri, generalmente di fibra di vetro, su cui si deposita il tessuto con il ligando legato ai recettori. Prima della filtrazione si dispensa il tampone freddo nel mezzo d’incubazione, quindi si effettua un ulteriore lavaggio che ha lo scopo di allontanare dai filtri la radioattività non legata; il tutto viene eseguito utilizzando il tampone freddo, per bloccare la reazione e rallentare la velocità di dissociazione del complesso ligando-recettore)
5)DETERMINAZIONE RADIOATTIVITA'
mediante beta-counter
6)ELABORAZIONE MATEMATICA E GRAFICA DEI DATI OTTENUTI:
CALCOLO DELLA Kd, Bmax E COSTANTI CINETICHE
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Nastenka
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
Inserito il - 29 luglio 2009 : 13:46:37
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Grazie, grazie, grazie!!! 
Mi sei stata di grandissimo aiuto!  |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2011 : 16:44:18
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| ciao saresti cosi gentile da spiegarmi i tre esperimenti , di saturazione, di competizione e di cinetica. te ne sarei grato, grazie |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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