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kachy
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41 Messaggi

Inserito il - 08 aprile 2018 : 00:20:16

Scritto da MolecularLab Mobile

Salve a tutti. Normalmente dopo una purificazione di proteine , passo il tutto in dialisi per eliminare il sale in eccesso o altro. Mi � stato detto che � possibile sfruttare i tubi concentratori, come gli amicon ultra, per effettuare degli scambi di buffer. Voi avete mai provato? Quanti giri in centrifuga servono per sostituire il buffer di partenza? Es passare da 50mM Tris 50mM NaCl a 20mM KPi?

Geeko
Utente

Citt�: Milano

1043 Messaggi

Inserito il - 08 aprile 2018 : 10:17:25

S� si pu� fare e a volte risulta comodo proprio quando poi hai in programma di concentrare la tua proteina. In quel caso utilizzi un unico concentratore e semplicemente fai pi� passaggi di diluizione e concentrazione usando il tuo buffer finale. Pu� essere una procedura un po' lunga (non che la dialisi non lo sia) soprattutto se parti con un grosso volume. Se il tuo volume di partenza non rientra in quello del concentratore io eviterei di usarlo e andrei di dialisi. L'ultima volta ogni passaggio dal campione da circa 10mL a circa 0.25mL ha richiesto 1 ora in centrifuga e l'ho ripetuto 3 volte; poi dipende dal tuo campione e dal tuo buffer. L'altro vantaggio della dialisi � proprio che eviti di dover sottoporre il campione a concentrazione che pu� essere fatale per alcune proteine che tendono ad aggregare.
L'alternativa migliore alla dialisi secondo me � usare una colonna da buffer-exchange, che si basa sul principio di cromatografia a esclusione molecolare. Ne vendono anche per i piccoli volumi (0.1-4mL) da usare in centrifuga. Sono molto pi� veloci e non ti concentrano il campione.