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Heather
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Cittā: Montorio al Vomano
12 Messaggi |
 Inserito il - 30 marzo 2011 : 23:41:16
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Lavoro con sezioni di cervello di topo su cui effettuo tantissime immunofluorescenze, ma sfortunatamente ci siamo accorti che, oltre alla ben nota lipofuscina, c'č qualcos'altro che dā una specie di autofluorescenza di fondo...qualcuno ha avuto problemi simili?da cosa potrebbe dipendere? io so che la paraformaldeide, con cui viene perfuso il topo, non dā autofluorescenza! spero ci sia una soluzione!!! grazie 
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chick80
Moderatore
Cittā: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 31 marzo 2011 : 08:55:49
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A volte redisui di emoglobina danno quel problema. Io perfondo con qualche ml di PBS prima di passare alla PFA e generalmente aiuta.
I fissativi, in quanto aldeidi, danno background fluorescence. La PFA generalmente non dā grossi problemi. Se mai fissassi con glutaraldeide, invece, preparati ad una fluorescenza di fondo piuttosto evidente. In quel caso puoi trattare le fettine con sodioboroidruro (NaBH4). Ovviamente un'opzione č quella di ridurre la concentrazione di fissativo ad es. PFA 2%, anche se io non ho mai avuto troppi problemi a 4%.
Poi ovviamente dipende dagli anticorpi e dalla regione del cervello che stai guardando: alcune zone sono molto "appiccicose".
In quel caso puoi aumentare la concentrazione di BSA durante l'immuno (1-4% dovrebbe essere OK).
Un'altra cosa che puoi usare se la fluorescenza di fondo č davvero resistente č quella di trattare le fettine chimicamente dopo l'immuno.
Questo PDF dā molti dettagli e referenze interessanti.
In sostanza:
Per la lipofuscina puoi usare il Sudan Black 0.3% (w/v) in etanolo 70% (vedi ad es: Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections., questo č il trattamento che ho sempre visto usare).
Un'alternativa a quanto pare č quella di fissare con 0.2% acido picrico e PFA 2% in PBS invece che solo PFA.
Anche l'elastina ed il collagene possono dare autofluorescenza. In quel caso puoi trattare con 0.5% pontamine sky blue o 0.1% toluidine blue per 1-5 minuti.
A quanto pare č possibile fare un trattamento di pre-bleach esponendo le fettine a 4 diverse lunghezze d'onda diverse per 12-48 ore prima di mettere i fluorofori. Non ho mai fatto una cosa del genere e sinceramente a meno che tu non sia in una situazione disperata eviterei un trattamento che mi raddoppia la lunghezza dell'esperimento... |
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Heather
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Cittā: Montorio al Vomano
12 Messaggi |
Inserito il - 31 marzo 2011 : 12:38:17
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@chick80
grazie! ho trovato molto interessante i tuoi link...cmq anche noi in genere perfondiamo prima con PBS e poi con PFA 4% e per l'immuno usiamo BSA 4%. In parte credo dipenda anche dallo spessore della sezione (14 micron al criostato)...ora stiamo studiando la regione dei ventricoli laterali e alcune cellule ependimali sembrano autofluorescenti...mah! č da indagare! cmq grazie ancora  |
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