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GfCampione
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Perugia
36 Messaggi |
 Inserito il - 28 ottobre 2007 : 18:16:42
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Ciao a tutti,
imminente esame di farmacologia molecolare.....Mi servono informazioni sulla LUCIFERASE ARRAY e DUAL-LUCIFERASE REPORTER ASSAY
principalmente sui principi, sull'azione molecolare e sulle fasi di esperimento....praticamente tutto quello che sapete........
grazie a tutti
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
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GfCampione
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Perugia
36 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2007 : 18:41:22
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ti ringrazio darkene, ma a me nn serve la spiegazione dello strumento ma la spiegazione del principio e di cosa avviene....inoltre se qualcuno trova anche un esempio di protocollo........
che disperazione !!!!!!!!!!!!!! |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2007 : 19:16:09
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allora il principio è semplice:
la luciferasi è un gene che produce una proteina fluorescente. questo è utilizzato in lab come gene reporter, ossia un gene che ti permette di valutare l'azione di una sequenza all'interno di un sistema cellulare. nel saggio luciferasi tu vai a testare se una sequenza di tuo interesse ha azione promotrice (quindi a livello trascrizionale). facciamo un esempio.
vuoi sapere se un certo Fattore Trascrizionale (chiamiamolo TF) transattiva il promotore del gene X.
quello che fai è prendere un plasmide (si vende)contenente il gene luciferasi. inserisci a monte di tale gene la sequenza del promotore (o presunto promotore). a questo punto co-trasfetti in cellule una quantità fissa di vettore reporter (promotore-luciferasi) da solo e con quantità crescenti di vettore esprimente il TF. dopo di solito 48h le cellule vengono raccolte, si estraggono le proteine che vengono lette al luminometro, strumento che legge alla lunghezza d'onda della luce emessa dalla luciferasi, dandoti un valore. se trovi che il valore di letture aumenta all'aumentare della quantità di TF trasfettata (di solito si arriva ad un plateaux), vuol dire (in linea di massa) che in quelle condizioni il TF transattiva il tuo promotore. ricorda che questo non ti dice se effettivamente il TF lega il promotore. per sapere questo dovresti fare una ChIP (Chromatin Immuno Precipitation).
Per quanto riguarda il sistema DUAL, è la stessa cosa, solo che assieme ai plasmidi di prima trasfetti anche un altro che esprime (sotto il controllo di un promotore che di solito è di CMV) una luciferasi che emette una radiazione diversa dalla precedente. questo ti offre uno strumento di normalizzazione, nel senso che dato che CMV è legato da fattori base (quindi devi essere sicuro che il tuo fattore non transattivi CMV!), la quantità di luciferasi espressa sotto CMV è proporzionale al numero di cellule trasfettate. quindi dividendo il valore di lettura della prima luciferasi per la seconda, avrai il valore normalizzato.
Altri dubbi? |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2007 : 23:04:26
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La luciferasi non e' una proteina fluorescente, ma un enzima che, in presenza di luciferina (il suo substrato) e ATP, catalizza la reazione che produce oxyluciferina, AMP e bioluminescenza!
http://en.wikipedia.org/wiki/Luciferase
Quindi prima di misurare i tuoi campioni devi aggiungere luciferina ad ATP.
Aggiungerei che non e' necessario estrarre le proteine, ma si possono fare misurazioni in tempo reale (chiaramente dipende da che campioni si usano in partenza).
Il saggio della luciferasi puo' essere usato per scopi diversi.. Per esempio anche per misurare la variazione della concentrazione di ATP intracellulare: piu' ATP c'è, piu' il segnale e' forte a parita' di molecole di luciferina e luciferasi.
Inoltre sembra essere un sistema molto piu' specifico della fluorescenza. Infatti per quanto riguarda la bioluminescenza i valori di background son di solito molto vicini allo zero.
Trovi moltissimi lavori a riguardo, te ne allego uno sull'uso di questo sistema su cellule intatte di lievito. Dovrebbe essere uno dei primi in cui hanno rimosso la sequenza di localizzazione al perossisoma presente nella luciferasi. Ora la maggior parte dei plasmidi in circolazione e' senza tale sequenza, il che permette di avere segnali piu' elevati!
Allegato:  luciferase protocol.pdf
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jenny83
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 08 febbraio 2013 : 14:32:27
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| Volevo chiedervi una cosa sulla luciferasi. Su che base vengono scelte le cellule da trasfettare? Se ho una sequenza umana posso usare lo stesso una linea di topo e viceversa? Grazie |
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lucibrandi
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2014 : 15:53:55
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| Salve a tutti, qualcuno saprebbe dirmi se è possibile fare esperimenti di luciferase assay su cellule in sospensione? Leggendo il protocollo promega mi sembra di capire che possono essere utilizzate solo cellule in adesione. Grazie mille |
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Miki_
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
Inserito il - 30 gennaio 2014 : 12:27:20
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| un mio collega li ha fatti e han funzionato..non credo ci siano problemi tecnici particolari. L'unico fattore limitante è l'efficienza di transfezione che (per mia esperienza) nelle cellule in sospensione è minore. |
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lucibrandi
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 21 maggio 2014 : 17:17:20
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| qualcuno di voi sa dirmi come è meglio impostare il luminometro per leggere un esperimento di dual luciferase assay? Nel protocollo promega è indicato di fare specificatamente una lettura a 10 secondi, ma impostando lo strumeno sulla funzione di lettura '' single'' o kinetic? Grazie mille |
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Luciferase
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