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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
 Inserito il - 29 luglio 2010 : 20:22:04
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Ciso a tutti, sfiga vuole che è da circa un mese e mezzo che non mi riesce un esperimento di clonaggio. In grandi linee fin'ora ho fatto:
-amplificazione dell'inserto con primer contenenti siti di restrizione adatti al clonaggio
- corsa dell'amplificatoin gel d'agarosio, geneclean della banda d'interesse, quantificazione del DNA estratto, digestione precipitazione in etanolo e riquantificazione.
-digestione del vettore in cui clonare l'inserto, elettroforesi+geneclean del digerito+quantificazione
-Ligasi con rapporto vettore-inserto 1:3
-Trasformazione batteri, piastratura, miniprep, elettroforesi: a questo punto però ottengo sempre solo la banda del vettore (cloni con il vettore richiuso senza inserto), ciò nonostante l'uso di enzimi di restrizione con siti diversi e defosforilazione delle estremità del vettore con fosfatasi. Nella piastra di controllo (stessi batteri trasformati con stesse quantità di inserto-vettore-buffer ligasi-H2O ma senza ligasi) come atteso non ci sono colonie.
HELPP
DOMANDA: è possibile eseguire la digestione anzicchè dopo il geneclean dopo la precipitazione?
DOMANDA 2: E' possibile non fare il geneclean del vettore e ligarlo direttamente dopo la digestione?
DOMANDA 3: Qualsiasi cosa vi venga in mente che può essermi di aiuto
GRAZIEEEE
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 29 luglio 2010 : 22:14:01
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Domanda 1: per geneclean intendi purificazione da gel, con colonnine giusto? Se così, beh sì puoi fare la digestione dopo precipitazione però non ne vedo l'utilità... primo perchè dopo purificazione hai un prodotto già pulito e pronto per le tue applicazioni, secondo perchè se lo purifichi dal gel e poi lo riprecipiti comunque perdi ulteriore materiale (tra l'altro immagino che le quantità in gioco dopo il geneclean siano esigue, quindi se dopo la digestione precipiti ti consiglio di farlo O.N. a -20 per aumentare la resa di DNA precipitato).
Domanda2: generalmente sarebbe meglio estrarre il vettore dal gel dopo averlo digerito, soprattutto se con la digestione elimini un inserto preesistente, quindi defosforilarlo, ripurificare e ligare. Ci sono alcune fosfatasi che sono ottimizzate per lavorare con i buffer degli enzimi di restrizione (se non ricordo male la antarctic della NEB): in questo modo dopo aver digerito la aggiungi direttamente alla provetta senza purificare (una purificazione in meno significa un sacco di materiale in +).
Ora da quello che scrivi posso azzardare che:
1) la fosfatasi non funziona a dovere. Quanto tempo ce lo tieni il vettore? Io ce lo tengo generalmente 2 ore a 37°C, e a volte trovo del background anche in queste condizioni. Potresti anche aumentare un pò la quantità di fosfatasi
2) la digestione del vettore non è completa: se con la doppia digestione elimini un inserto abbastanza grosso dovresti distinguere facilmente il doppio digerito dal non digerito (o dal linearizzato). Occhio però che se con la digestione doppia elimini un frammento irrisorio potresti non distinguere bene ciò che ti interessa da ciò che è parzialmente digerito (dipende pure da quanto ne carichi, quanto fai correre, percentuale del gel etc). Gioca su questi fattori per avere una buona risoluzione su gel.
3) è possibile che il rapporto che usi (3:1) non sia quello indicato... quanto è grande il vettore? quanto l'inserto? hai provato a cambiare rapporto molare?
Ti consiglio per scrupolo di effettuare il controllo vettore senza inserto + ligasi (tu hai menzionato solo il controllo vettore + inserto senza ligasi, che esclude la presenza di background di plasmide non digerito). |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 29 luglio 2010 : 22:17:22
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| Dimenticavo di chiedere: quanto tempo la tieni la ligation? |
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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 29 luglio 2010 : 23:21:17
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Grazie!! La fosfatasi la tengo 1h a 37°C, posso provare a tenerla 2h; in effetti oggi sei la seconda persona che mi suggerisce il controllo vettore senza inserto + ligasi e di cambiare rapporto vettore:inserto (se hai suggerimenti anche a riguardo...il vettore è di 4,5Kb mentre l'inserto è di circa 0,4Kb).
Tornando alla fosfatasi, mi chiedevo com'è possibile che il vettore si richiuda dopo averlo digerito con 2 enzimi che non creano estremità coesive tra loro (EcoRI e BamHI)?
Invece tornando alla digestione del vettore, con geneclean hai capito giusto: taglio la banda dal gel e purifico il DNA con colonnine,ma visto che nella line del gel dove corro il vettore digerito ottengo solo una banda (i siti di restrizione nel vettore sono piuttosto vicini e il frammentino interposto non lo visualizzo nemmeno su gel), mi chiedevo appunto se era proprio necessario eseguire il geneclean e se nn fosse possibile ligare direttamente (mi è venuto in mente perchè durante un'esercitazione all'università avevamo ligato direttamente..però era solo un'esercitazione didattica, non so com'è la prassi)...grazie ancora |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 30 luglio 2010 : 10:09:38
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Tenere la fosfatasi per più tempo è una buona idea. Il controllo vettore + ligasi (senza inserto) è un controllo essenziale, quindi ti raccomando di farlo. Per quanto riguarda il rapporto io manterrei quello (3:1), prova a tenere la reazione overnight (se non lo hai già fatto) a 16 °C (io in genere la tengo o.n., oppure 1-2 ore a r.t., trasformo con metà del volume di reazione -10ul su 20- e il resto lo metto a 16°C, così se nn ho nulla con la prima reazione procedo con la seconda).
Se la doppia digestione del vettore, che lascia due estremità diverse, è completa è teoricamente impossibile che si richiuda su se stesso: questo accade solo se i due enzimi che hai usato sono isocaudomeri (generano estremità coesive identiche pur tagliando sequenze leggermente diverse). In taluni casi la ligasi può anche ligare due estremità parzialmente complementari (molto raro). Infine, se la differenza in massa molecolare tra vettore parzialmente digerito e doppio digerito è minima, può accadere che quando vai a purificare dal gel l'uno ti prendi un pò dell'altro. Non credo però che il tuo problema rientri nelle prime due casistiche, forse nella terza, ma è solo un'ipotesi (non conosco i dettagli della tua digestione, quindi è difficile dire quale sia il problema). E' possibile inoltre che la fosfatasi non ti abbia funzionato perfettamente e ti si siano ligati vettore con vettore (concatameri). Puoi facilmente verificare questo tagliando il plasmide che hai ottenuto con uno solo dei due enzimi che hai usato per il clonaggio (per esempio EcoRI o BamHI, che suppongo riconoscano siti unici nel vettore) e guardando a che altezza ti migra rispetto al vettore senza inserto. |
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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2010 : 22:22:11
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| Ciao! domani finalmente riinizio e seguirò i tuoi suggerimenti. Stavo giusto rileggendoli... io di fosfatasi fin'ora ho sempre messo 1 microlitro su 40 di vol di digestione 1h a 37°C. Mi suggerisci di aumentare il volume di fosfatasi, il tempo o entrambi?? Potrei mettere 2 microlitri di fosfatasi per 2h a 37°C, ritieni sia una cosa opprtuna? Grazie mille, spero di non doverti più stressare con tutte queste domande :D |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2010 : 23:59:43
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nessuno stress. Io uso un ul di CIAP su 60 totali (in genere) e tengo la reazione 2 ore a 37 °C (ho provato pure a tenerla un pochinino di +). Poco tempo fa ho usato due ul di fosfatasi per due ore a 37°C, senza riscontrare differenze rilevanti rispetto alla reazione con un solo uL di CIAP. C'è da dire che nn so quale CIAP usi tu e a quale concentrazione sia, ma intanto potresti provare ad aumentare semplicemente il tempo. Se non dovesse venirti lo stesso prova anche ad aumentare la concentrazione di fosfatasi, la quantità di inserto, ecc... A volte ci vuole tanta pazienza e tanti tentativi.
In bocca al lupo |
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