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Subbenga
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
 Inserito il - 22 febbraio 2011 : 20:29:57
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E` la prima volta che sto tentando una reazione di ligazione. Dopo aver letto un molte cose ho iniziato il mio lavoro con questi semplici passaggi:
1) PCR dell`inserto su DNA genomico 250 bp (purificazione)
2) digestione dell`inserto e del plasmide (7000bp) col primo enzima di restrizione KpnI (purificazione)
3) digestione dell`inserto e del plasmide col secondo enzima SacI
4) corsa su gel
5) purificazione del plasmide e dell`inserto da gel
6) quantificazione inserto (circa 30ng/uL) e plasmide (circa 12 ng/uL)
7) calcolo del rapporto molare inserto:vettore. Ho provato 3:1, 1.5:1 ed 1:1. 100ng di plasmide
8) reazione di legazione (Rapid DNA ligation-fermentas-5` a 22 gradi C)
9) trasformazione di 50uL di cellule competenti con 2uL di reazione
10) ho messo le cellule a crescere con controllo positivo (vettore uncutted+cellule) e due controlli negativi (vettore cutted) e solo cellule. Solo il controllo positivo cresce.
Potete darmi qualche consiglio su cosa modificare del mio protocollo?
Grazie
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 04:57:55
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| al punto 7, a mio dire, hai usato troppo dna.usa tra i 30 e i 50 ng di plasmide totali e relativi ng di inserto,secondo quanto calcolato dal rapporto molare. 3:1 va piu che bene.generalmente in una ligation è meglio nn eccedere i 100 ng totali di dna. Poi trasforma cn meta della reazione,dieci ul dato che il volume solitamente è 20. Se nn hai gia buttato la reazione,ma l'hai conservata a meno20,prova ad aumentare un po il volume con cui trasformi. In caso nn ti viene nulla,ripeti ligation. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 09:29:08
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le variabili sono talmente tante e ogni step se non fatto accuratamente puo' essere "fatale", io quello che ti consiglio è di abbassare
la temperatura di reazione metti a 12-16°C over night e prima di trasformare fai una PCR su un ul o 0,5 ul di reazione di ligazione
almeno non perdi tempo a trasformare aria fritta |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 10:39:25
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ma fa prima a trasformare che a farsi una pcr pat.
3:1 è un buon rapporto e 100 ng di vettore dovrebbe andare. sono d'accordo con spemann, 2 ul di ligation per trasformare sono pochi. io farei una ligation in 10 ul e poi trasformerei tutto. altra cosa, le tue cellule che efficienza hanno? |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 11:57:46
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bhe, usando un primers sul vettore e uno sull'inserto se non hai la banda, vuol dire che la ligazione non è avventuta ed e' inutile perdere una notte per la trasformazione quando potresti sfruttarlo per fare un'altra ligazione cambiando magari alcune condizioni, io in genere la ligazione la faccio in 10ul di cui 5 li trasformo in 50ul di cellule competenti ( efficienti 10^6 )ed il resto se ho problemi lo carico sul gel e ci faccio la PCR
i problemi a mio parere possono essere:
1) purificazione dal gel con kit che lasciano della resina quindi il DNA non è abbastanza pulito
1)la fosfatasi alcalina non inattivata come si dovrebbe
3)DNA troppo diluito sia di vettore sia di inserto( sempre a mio parere ), è meglio usare DNA molto concentrato affinchè se diluito in TE o something else non influisce anche minimamente sulle condizioni di reazione
4)ti consiglio di clonare l'inserto in un vettore quale pJET o TA easy vector prima di clonarlo nel tuo vettore, in questo modo sei sicuro che il tuo inserto è stato digerito completamente, se non hai la possibilità fai la digestione dell'inserto over night ed usa rapporti 1:6 o 1/10 di iserto
5)controlla l'efficienza di trasformazione delle tue cellule
6)per la trasformazione se usi il metodo heat shock usa questo protocollo http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=5 ( se li metti ad incubare con NZY è meglio ), se l antibiotico che usi è amp va bene 30 minuti visto che non so quale usi, nel dubbio lasciali 40 minuti a 37°C
7) fai un controllo della ligasi, per vedere se funziona o meno fai la ligazione con un marker ( oviamente senza colorante ), ci metti 2 ore e vedi se hai uno smear o se si mantiene come ladder
good luck!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 12:05:25
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| Se ha purificato da gel, e quindi passato sule resine, non mi preoccuperei tanto della fosfatasi alcalina che viene rimossa efficientemente durante i lavaggi della resina stessa. Secondo me o è un problema di quantità di DNA immessa nella reazione, o un problema di quantità usata per la trasformazione: 2ul sono davvero pochi, in genere è meglio trasformare con metà del volume di reazione (e conservare l'altra metà!) |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 12:14:11
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dipende, c'e' chi fa la purificazione prima del DNA e poi tratta con fosfatasi fa direttamente la ligazione, e c'e' chi mette la fosfatasi subito dopo la digestione e poi purifica
perchè la conservi l'altra metà  ?? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 12:42:53
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già, infatti io la fosfatasi la metto direttamente nella mix di digestione.
L'altra metà la conservo perchè puo' sempre tornare utile, metti che il problema stia nei batteri, che magari nn trasformano molto efficientemente, cambio batteri e utilizzo l'altra metà per trasformare.
Diciamo che non butto via nulla :) |
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Subbenga
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 14:24:36
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| Ringrazio tutti per i preziosi consigli ma devo confessare che non ho usato la fosfatasi alcalina perchè ho letto che è un passaggio non necessario quando si usano 2 enzimi diversi. Proverò quindi ad aumentare la quantità di trasformante e se non va bene utilizzerò la fosfatasi. Grazie tanto a tutti, siete stati utilissimi. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 15:18:23
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ok, facci sapere :). Un ultimo consiglio... la fosfatasi usala anche quando digerisci con due enzimi diversi, non sempre la doppia digestione è completa e non sempre sei in grado di vedere la differenza tra singolo e doppio digerito (o eventualmente separare le due specie).
In bocca al lupo! |
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Subbenga
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 18:21:15
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Devo comunicarvi che dopo 2 giorni su una piastra rapporto 3:1 e` cresciuta una colonia :)!!!Non che abbia grossissime speranze che sia buona ma ho iniziato la miniprep.
Le mie cellulehanno un`efficienza di 1X10^6 (MAX Efficiency DH5a Conpetent cells).
Mi dispiace ma non ho il primer sul plasmide e non posso amplificare :( purtroppo sono arrivato in un laboratorio nuovo a fare una cosa nuova e questo complica le cose, per di piu` all`estero.
Avrei un`altra domanda: Io piatro tutto su una piastra perche` gia` cosi` non cresce niente 400 uL circa. Ho letto che puo` essere dannoso e` vero? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 18:28:25
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| in che senso dannoso? il rischio nel piastrare 400ul forse è che se ti ha funzionato troppo bene la ligation avrai un tappetino di batteri (a me a volte è capitato)... |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 18:29:11
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io farei una colony pcr prima di fare la miniprep....cmq spero che sia positiva la culo.nia
in genere si preferisce non andare oltre i 300ul , tuttavia puoi sempre dare uno spin alle cellule, eliminare 200 ul di LB,SOC,NZY che sia , risospendi e piastri
se pensi che la ligation sia una bomba, puoi piastrarne in una 50ul un altra 100 ed il resto in un altra piastra( non mi pare il tuo caso comunque ) |
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Subbenga
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 21:56:47
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Come avete letto la mia ligation e` tutto tranne che una bomba. Ma dicevo dannosa perche` effettivamente lascio asciuare sotto cappa le mie piastre per 5 minuti ma quando le metto nell`incubatore sono ancora bagnate ed ho letto che devono essere asciutte (capisco che stiamo esagerando :) ).
Ieri ho mandato una ligazione O.N. e stasera piastro. Fino ad ieri avevo utilizzato max 4 uL di ligation con Vf 20uL. Oggi faro` la trasformazione con 10 come consigliato da voi.
Grazie ancora vi faro` sapere sperando di darvi buone notizie. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 22:01:56
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| metti 5ul di reazione di ligazione in 50ul di cellule competenti |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2011 : 22:37:08
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| allora incrociamo le dita x te!per le piastre, mettile a 37 gradi una mezz ora prima di piastrare e vedrai che si asciugano |
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Subbenga
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2011 : 22:58:55
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Cari Ragazzi purtroppo niente e` cresciuto e mi sembra di avere problemi anche con la mia piccola colonia. Oggi ricomincio tutto. Avrei pero` delle domande.
Molti mi hanno parlato di defosforilare ma mi chiedo se non defosforilo ed il plasmide si riattacca non dovrei trovare molte colonie (falsi positivi) sul mio gel?
Per la quantificazione del mio plasmide e del mio inserto ho utilizzato il Nanodrop. Io penso che sia uno degli strumenti piu` precisi in commercio :) ma se per qualche motivo mi sbaglia il calcolo io sto sbagliando il rapporto!!!Penso di dover quantificare al nanodrop ma correre tutto anche su gel.
Grazie per il suggerimento di mettere le piastre mezz`ora prima nell`incubatore, ora e` tutto asciutto.
Pensate ci possano essere molti problemi se metto troppo inserto?
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Subbenga
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2011 : 00:29:25
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| Ho appena corso 10 uL della mia ligazione e non vedo assolutamente niente. Questo vuol dire che ho sovrastimato il mio inserto ed il mio vettore? Dovrei pure vedere qualcosa??!!!??? |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2011 : 01:43:28
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non fidarti troppo del nanodrop specialmente quando la quantità di DNA è bassa, usa la vista ... hai un massRuler marker?è la cosa migliore
inoltre non dovresti vedere niente o meglio ..dovresti vedere uno smear ed il vettore clonato a volte se la ligazione e' avvenuta, non devi usare molto inserto ma come ti ho detto se hai digerito l'inserto direttamente con gli enzimi usa rapporti maggiori , poi i primers li hai disegnati in maniera corretta? hai messo uno spacer dall inizio del primers all sito di taglio almeno di 3 nt? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2011 : 07:23:33
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cm ti ha detto anche patrizio,la quantificazione su gel è il metodo migliore.corri sullo stesso gel vettore inserto e un ruler che permetta la quantificazione(cioè bande a conc nota,io uso smart ruler).per quanto i miei occhi possano essere imprecisi,mi hanno dato risultati sempre migliori dello spettrofotometro
in my humble hopinion,invece,ha poco senso correre la reazione di ligazione,nn avrai infatti solo il tuo clonaggio ma anche altri prodotti di ligazione.cosa ti aspetti di vedere quindi? Prova a ripetere la ligation. Io in genere mi fido poco dei kit 5 minuti,uso il vecchio sistema,un'oretta a rt o overnight a 16 gradi. Guarda tu se è il caso di cambiare durata di reazione. Questa volta prova a quantificare su gel,almeno 6 sicuro ke qualcosa ce l'hai. C'è infine la possibilità che la ligasi o l'atp del buffer siano scassati.il buffer è aliquotato?è stato cong-scong piu volte?se sospetti possa essere quello, cambialo o aggiungi atp |
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Subbenga
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2011 : 09:07:59
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Cari colleghi come sempre siete utilissimi. Si ho aggiunto 4 nt al mio primer prima del sito riconosciuto dal mio enzima di restrizione. Ho ligasi veramente nuove che devono essere usati come Rapid Ligasi ma non so se li posso usare per un'ora o over night. La mia ligasi O.N. è invece più vecchia e non so bene a quanto risale. Cmq domani lavorerò e cercherò di non fidarmi solo "ciecamente" :) del nanodrop.
Grazie |
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Subbenga
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2011 : 17:54:40
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Cari Colleghi,
ho ricominciato tutto daccapo ed ora mi ritrovo di nuovo i miei digeriti per poter ritentare la ligazione. Questa volta i miei digeriti sono piu` concentrati (inserto 42.7ng e vettore 28.2ng). Ho quantizzato al nanodrop ma questa volta ho testato tutto su gel ed i risultati sono perfettamente sovrapponibili. Tutto mi sembra perfetto ma l`unico dato che mi lascia un po` perplesso e` il rapporto 260/230 rispettiamente di 0.06 o 0.28. Probabilmente la mia estrazione da resina mi fa portare con me qualcosa :(. A questo punto che concentrazione mi consigliate per la ligazione?
Grazie |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2011 : 17:58:17
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| Se intendi il rapporto inserto:vettore, io tenterei sempre 3:1 |
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Subbenga
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2011 : 17:59:23
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Un`altra domanda. E` importante il rapporto cellule ligation? Se uso 10uL di ligazione posso mantenere costante il volume di cellule 50uL?
Grazie |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2011 : 18:07:16
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| Io uso 10 ul di ligation in 100 ul di cellule, le quali hanno un'altissima efficienza di trasformazione (nn ricordo il valore). |
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Subbenga
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2011 : 18:12:36
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| Ma voi con rapporto 3:1 intendete il rapporto molare con la solita formula o semplicemente il rapporto in ng ra inserto e vettore. Oggi ho chiesto ad un ragazzo che fa un po` di ligazioni e mi ha dato semplicemente il rapporto in ng. Magari e` meno complesso ma piu` efficiente. Grazie Spemann |
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Didattica e Relazioni
