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melyila88
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7 Messaggi |
 Inserito il - 16 gennaio 2010 : 17:53:58
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Ciao a tutti!!!Qualcuno potrebbe spiegarmi la tecnica LAMP??La variante della pcr che utilizza la BST polmerasi?Non riesco a capire che cosa succede dopo che si è attaccato il primo primer interno FIP..avviene la sintesi del filamento complementare e poi?Si attacca F3?
Grazie mille a tutti....l'esame di ing genetica è vicino..sigh..
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ukitel
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78 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2010 : 18:25:23
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Purtroppo ora non ho tempo per descrivertela nel dettaglio ma se sei pratica di inglese posso mandarti la pubblicazione dei tizi che l'hanno inventata.
Ci sono dei disegni più o meno esplicativi, che ti aiuterebbero a capire, anche se il processo è veramente complicato e tutt'ora non sono sicuro di averlo capito precisamente. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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melyila88
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7 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2010 : 00:20:53
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Grazie per il link ho già dato un'occhiata ma domani guardo meglio...se però ci fosse qualcuno in grado di spiegarmela brevemente..non importa il dettaglio..giusto per capire a grandi linee la tecnica..qualcosa di inglese so però leggermi tutto..
Grazie cmq!!
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ukitel
Nuovo Arrivato
78 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2010 : 11:23:06
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@GFPina
Grazie, non ricordavo che fosse gratuita.
@melyila88
Ti dò qualche "dritta" allora.
Tieni presente in primo luogo che è isotermica. Quindi data l'assenza dei cicli di temperatura come nella PCR, bisogna "raggirare" alcuni problemi.
In primo luogo quello della temperatura: i tuoi primer si ibridano a una certa temperatura, che è più bassa di quella "operativa" della Taq normale.
Poi la denaturazione: gli stampi devono tornare liberi, a singolo filamento, una volta che la polimerasi ha sintetizzato il filamento. Questo viene ottenuto tramite la polimerasi, capace di lavorare a temperature più basse e soprattutto capace di scalzare il filamento che ha di fronte, e non degradarlo come la Taq normale: man mano che viene scalzato il singolo filamento libero può diventare un ulteriore stampo su cui ibridare altri primers.
Lo step iniziale: Se ci rifletti, comunque, una volta sintetizzato il primo filamento del "target" sul DNA, questo non può essere scalzato a meno di ibridare sul genoma un ulteriore primer a monte (c'è tra i primers una coppia che fa proprio questo): la polimerasi sintetizzando incontra il filamento target più a valle e lo solleva a partire dalla sua estremità 5'.
Le forcine: Se ricordi, il primer al 5'possiede una zona che non ibridizza subito. Proprio in questa fase si ripiega sul filamento e forma una struttura a forcina, un loop: ripiegandosi mette un piccolo innesco 5' sul filamento, che può essere amplificato.
I concatenameri: grazie a questo stratagemma dallo step iniziale vengono formati tanti "monomeri" separati che hanno all'estremità un loop (la struttura 9 dell'articolo). E' come se il target sul genoma producesse in continuazione questi monomeri, tutti uguali. FIP e BIP poi sono capaci di ibridarsi sui loop e mettere in comunicazione i monomeri. Le estremità 5' sono allungate e di fatto i monomeri vengono saldati, ma la dinamica di questo processo è abbastanza complicata per le varie varianti "strutturali" che possono formarsi, ma che sono tutte "corte". Esiste, invece, una variante principale costituita da una lunghissima catena, un concatenamero, con tutti i monomeri in fila. |
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