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biotool
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 Inserito il - 24 maggio 2012 : 00:18:37
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Ciao a tutti!
Ho provato a cercare in discussioni vecchie ma non ho trovato nulla nello specifico. Vorrei un consiglio: per l'estrazione di proteine da cellule in adesione per poi effettuare un western blot, utilizzo questo buffer: NaCL 150 mM, Tris pH 8 50 mM, Na deoxycholate 0.5%, SDS 0.1%, Na4P2O7 10 mM, EDTA 5 mM, poi freschi inibitori proteasi, fosfatasi, triton 1%, dtt 1%.
Mi sembra un buffer piuttosto forte, pero' durante la lisi vedo degli aggregati che rimangono non solubili. Il WB viene bene, ma la resa proteica non e' fantastica. Secondo voi cosa posso modificare/aggiungere per aumentare la solubilita'?
Utilizzare il glicerolo al 10 % gia' nel lysis buffer puo' aiutare? (anche se di solito si usa metterlo giusto per caricare il campione nel gel e per preservare le proteine che rimangono e si congelano, mettendolo nel lysis dovrebbe ridurre interazioni proteina-proteina e quindi probablmente aumentare la solubilita') avete esperienza a riguardo o altri consigli?
grazie mille
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biotool
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97 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 14:35:51
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| nessuno sa aiutarmi? |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 17:50:12
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| Il buffer mi sembra apposto, quante cellule lisi? in che volume lisi? qual'è la concentrazione proteica che ottieni? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 17:55:05
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Una volta diluii distrattamente l'SDS allo 0.1% invece che allo 0.001%, in un buffer simile al tuo, e dopo un'oretta a 4°C ebbi dei bellissimi precipitati di SDS, dovuti alla combo alta concentrazione di SDS-bassa temperatura.
Non è che tu hai un problema analogo? |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 18:44:02
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Una volta diluii distrattamente l'SDS allo 0.1% invece che allo 0.001%, in un buffer simile al tuo, e dopo un'oretta a 4°C ebbi dei bellissimi precipitati di SDS, dovuti alla combo alta concentrazione di SDS-bassa temperatura.
Non è che tu hai un problema analogo?
Non credo che sia questi il problema, la SDS allo 0.1% non dovrebbe dare fastidio[1]. Non capisco perchè usi un buffer a pH diverso da quello fisiologico 7.5 [1,2]. Spulciati la sezione Troubleshooting della referenza 1
1. http://www.piercenet.com/instructions/2161782.pdf
2. http://www.cellsignal.com/pdf/9806.pdf |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 18:52:19
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Citazione:
Messaggio inserito da Martin.diagnostica
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Una volta diluii distrattamente l'SDS allo 0.1% invece che allo 0.001%, in un buffer simile al tuo, e dopo un'oretta a 4�C ebbi dei bellissimi precipitati di SDS, dovuti alla combo alta concentrazione di SDS-bassa temperatura.
Non � che tu hai un problema analogo?
Non credo che sia questi il problema, la SDS allo 0.1% non dovrebbe dare fastidio[1]. Non capisco perch� usi un buffer a pH diverso da quello fisiologico 7.5 [1,2]. Spulciati la sezione Troubleshooting della referenza 1
1. http://www.piercenet.com/instructions/2161782.pdf
2. http://www.cellsignal.com/pdf/9806.pdf
Errore nel mio messaggio: 0.01 invece di 0.001%. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 19:48:01
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Ciao
Puoi provare ad usare un urea buffer per solubilizzare meglio le proteine. Oppure, provare a sonicare i pellet insolubili
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biotool
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 19:49:42
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Il ripa buffer e' molto simile, con la differenza che io uso il triton e nel ripa c'e' l'np-40, che pero' credo siano interscambiabili(entrambi non ionici) giusto? quindi non credo possa fare molta differenza..per il discorso pH hai ragione, non so perche' e' 8, potrebbe influire...
utilizzo in genere 80 uL per dish da 60 mm, dipende anche dal numero di cellule. Secondo voi il glicerolo puo' aiutare? conosco solo in un lab che lo usano nel LB, e non mi hanno neanche saputo dire bene il motivo, ma cercando in letteratura sembra aiuti la solubilita'.. |
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biotool
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 19:53:35
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| ciao RM, grazie per rispondere, dopo aver raccolto le cellule in sospensione nel buffer le lascio in agitazione 20 min a 4 gradi C e poi le sonifico per 5 min e vortex, ma rimangono degli aggregati insolubili! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 19:54:37
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| Confermo che anche nel mio lab si usa un LB con glicerolo (al 3%), la ragione pero' la ignoro. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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biotool
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97 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 19:58:19
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| la concentrazione che ottengo e' intorno a 1 ug/uL |
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biotool
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 20:02:27
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ah grazie 0/1 dell'info! se riesci a carpirne il perche' fammelo sapere che sono curioso! Se effettivamente e' per la solubilita' posso provare ad aggiungerlo..ma per gli altri componenti il tuo LB e' simile al mio?
Nel lab che dicevo prima lo usano al 10% nel LB, in generale, a prescindere dalle cellule in studio. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 20:27:52
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Chiedero' appena mi ricordo.
Non ho gran tempo per legger la composizione del tuo buffer, concordo solo sul fatto che NP-40 e Triton non sono ionici.
In compenso copio-incollo direttamente la ricetta del mio LB:
-50 mM Tris pH 7,5
-200 mM KCL
-1 mM EGTA
-0,05% DDM
-3% Glycerol
-0,01% SDS
-Protease Inhibitor EDTA Free
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 23:06:46
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Secondo me lisi poche cellule, forse non fai arrivare i dischi a confluenza oppure non le raccogli tutte. Le stacchi con tripsina o vai di scraper?.
Devi annottare nei tuoi notebook il totale di cellule che vai a lisare la quantità di proteina totale che ottieni e la la concentrazione proteica (ovviamente)
numero di cellule | volume di buffer | ug/uL | ug tot
Io le cellule in coltura le lisavo spesso cosi:
1 tripsinizzavo i dischi
2 lavavo i pellet col PBS 2 volte
3 Congelavo il pellet [STOP]
andavo a prendere il sole, bere caffè espresso e mangiare sfogliatelle nel cortile dell'unina
4 il giorno dopo scongelavo e risospendevo il pellet nel ripa
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biotool
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 23:12:34
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| si certo, ma le cellule non sono poche, poi cmq non avrebbero senso gli aggregati. non ti ho detto il numero perche dipende dagli exp, ma questo fatto non dipende dal numero di cellule... |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2012 : 00:42:28
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Sulla base della mia esperienza è normale che lisando delle cellule vi sia una frazione insolubile.
Hai mai sentito parlare del Rasoio di Occam
Il glicerolo è un crioprotettore, i lisati comunque vengono congelati.
Puoi fare una pubmed con keyword = il nome delle tue cellule e vedere altri autori come effettuano la lisi. Oppure chiedere in giro a qualche collega che lavora su queste linee cellulari. |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2012 : 11:50:10
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| per prova: dopo la centrifugazione questi tuoi aggregati insolubili dovrebbero andare nel pellet. Tu prova a solubilizzare il pellet in sample buffer, fai bollire un bel po' e poi caricali su gel in rapporto volume/volume rispetto ai surnatanti che hai recuperato. La colorazione con il ponceau dovrebbe farti capire se quelli sono aggregati proteici o meno... |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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biotool
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97 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2012 : 17:18:37
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| FYI: anche con 10% di glicerolo nel lysis buffer la presenza di aggregati insolubili non diminuisce piu' di tanto. |
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