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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
 Inserito il - 24 agosto 2007 : 13:57:32
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Ciao di nuovo a tutti!avrei bisogno di un altro piccolo chiarimento:
la temperatura di melting è la temperatura a cui il 50% del DNA è denaturato. Quindi significa che metà DNA si trova sotto forma di singolo filamento?
Ho teovato una figura in rete in cui è disegnata una curva di melting con indicata la temperatura di melting; la porzione della curva prima della Tm è indicata come pre-melt phase(dsDNA, quella dopo la Tm invece(in cui la fluorescenza cala a picco) è indicata come post-melt phase(ssDNA).Questo significa che prima della Tm tutto il DNA è ancora a doppio filamento, mentre dopo la Tm è tutto a singolo filamento?
Grazie mille!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2007 : 14:34:48
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No! Altrimenti non avresti una curva!
Aumentanado la temperatura il DNA inizia a denaturarasi avrai l'1% di DNA denaturato, poi il 2%... ecc. fino ad arrivare al picco (Temperatura di melting) in cui il 50% del DNA è denaturato. Dopo il picco il DNA va avanti a denaturarsi qunidi hai 51%.... ecc fino a 100%.
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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2007 : 14:55:50
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ma allora perkè indicavano la pre melt phase con tra parentesi dsDNA,forse intendevano che la maggior parte del DNA è ancora a doppio filamento?
Quindi in pratica se nn ho capito male,all'inizio si rompono i legami più deboli(tipo tra AeT) poi man mano quelli più forti (GC) per cui ho più dna denaturato?
Un'altro mega dubbio: con le curve di melting è possibile rilevare polimorfismi e distinguere così omozigoti da eterozigoti, spesso nei vari articoli parlano in questi casi di omoduplex ed eteroduplex
ma durante la melting come si fanno a formare omo ed eteroduplex?
in genere non si formano quando mescolo un mozigote con un eterozigote..li denaturo, li faccio riappaiare e a seconda se è omozigote o eterozigote si formerà omo o eteroduplex?
Ho trovato che in genere nelle curve di melting gli omozigoti si notano perchè c'è uno spostamento della curva (perchè cambia la Tm)mentre per gli eterozigoti cambia la forma della curva ma nn ho capito xkè, nell'artic c'è scritto questo:
"For SNP analysis, homozygous allelic variants are characterized by a temperature shift in a melt curve whereas heterozygotes are characterized by a change in melt curve shape. The change in curve shape is a result of destabilized heteroduplex annealing between some of the wild type and variant strands. The heterozygote melting curve is thus a composite of both heteroduplex and homoduplex components,and, because it dissociates more readily, shift left to lower temperature"
Cosa significa la parte riguadante gli eterozigoti??
Infine l'ultimissima cosa:
ho letto che con la curva di melting è possibile distinguere un cambiamento di base del tipo A/T o G/C..quindi una transversione..ma come è possibile?il DNA che sia A o T; G o C
T A C G
non avrà sempre la stessa temperatura di melting?come fanno ad avere curve diverse in modo che io li possa distinguere
Grazie infinite!!!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 agosto 2007 : 16:32:13
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Citazione:
Messaggio inserito da kiki
ma allora perkè indicavano la pre melt phase con tra parentesi dsDNA,forse intendevano che la maggior parte del DNA è ancora a doppio filamento?
La figura a cui ti riferivi è questa?
La spiegazione è proprio questa:
Nella prima fase quando sei lontana dalla Tm il DNA inizia a denaturarsi ma molto lentamente e quindi la maggior parte del DNA è a doppio filamento (loro lo indicano come
"pre-melt phase (dsDNA)"), man mano che ti avvicini alla Tm la reazione è molto più veloce (quello indicato nel quadrato come "melt phase"), poi l’ultima fase è ancora lenta e la maggior parte del DNA è a singolo filamento ("post-melt phase (ssDNA)")
Citazione:
Un'altro mega dubbio: con le curve di melting è possibile rilevare polimorfismi e distinguere così omozigoti da eterozigoti, spesso nei vari articoli parlano in questi casi di omoduplex ed eteroduplex ma durante la melting come si fanno a formare omo ed eteroduplex?
in genere non si formano quando mescolo un mozigote con un eterozigote..li denaturo, li faccio riappaiare e a seconda se è omozigote o eterozigote si formerà omo o eteroduplex?
Ho trovato che in genere nelle curve di melting gli omozigoti si notano perchè c'è uno spostamento della curva (perchè cambia la Tm)mentre per gli eterozigoti cambia la forma della curva ma nn ho capito xkè, nell'artic c'è scritto questo:
"For SNP analysis, homozygous allelic variants are characterized by a temperature shift in a melt curve whereas heterozygotes are characterized by a change in melt curve shape. The change in curve shape is a result of destabilized heteroduplex annealing between some of the wild type and variant strands. The heterozygote melting curve is thus a composite of both heteroduplex and homoduplex components,and, because it dissociates more readily, shift left to lower temperature"
Cosa significa la parte riguadante gli eterozigoti??
Bella domanda! In effetti non è spiegato chiaramente, si parte dal presupposto che gli eteroduplex si siano formati prima di iniziare la fase di melting, nell’amplificato negli eterozigoti hai già una miscela di omoduplex e eteroduplex.
In realtà c’è un piccolo trucchetto che ti spiegano dopo:
L’eteroduplex è più instabile quindi si dissocia più rapidamente, l’eterozigote contenendo eteroduplex risente di questo effetto. Il fatto che si dissocia più velocemente fa si che la curva sia più pendente (spostamento a sinistra in figura)
Citazione:
Infine l'ultimissima cosa:
ho letto che con la curva di melting è possibile distinguere un cambiamento di base del tipo A/T o G/C..quindi una transversione..ma come è possibile?il DNA che sia A o T; G o C
T A C G
non avrà sempre la stessa temperatura di melting?come fanno ad avere curve diverse in modo che io li possa distinguere
Grazie infinite!!!!
La temperatura di melting non è semplicemente la somma delle Tm di ogni coppia di basi, ma dipende anche dalle basi che ci sono di fianco e dalla posizione delle basi... non so se è chiaro comunque su wikipedia trovi la spiegazione: DNA-melting
Il risultato è che esiste una differenza seppur minima di Tm (<0.2°C) nel caso di una transvesione A->T che può essere rivelato con la high melt resolution.
Scusa se ci ho messo un po' a risponderti ma in questi giorni non mi ero collegata!
(figure da: High Resolution Melt Assay Design and Analysis - Rotor-Gene 6000:
http://www.corbettlifescience.net/public/Rotor-Gene%206000/hrm_corprotocol.pdf)
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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 02 settembre 2007 : 18:46:32
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Grazie mille x l'aiuto!!scusa se ti ringrazio solo ora ma ho letto solo ora la risposta xkè ho avuto dei problemi con la rete.
Si erano proprio quelle le figure a cui mi riferivo!ora ho capito!!grazie infinite!! |
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