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munincha
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 Inserito il - 24 agosto 2009 : 10:39:41
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Salve a tutti,
qualche tempo fa abbiamo eseguito in laboratorio un esperimento sul silenziamento del gene dell'occhio in planaria, impiegando DsRNA sintetizzati in vitro. Abbiamo impiegato un frammento di fago M13, precedentemente sintetizzato e purificato, ma il problema lo riscontro proprio qui.
Il gene dal quale si vuole generare un trascritto senso e uno antisenso è inserito in un plasmide a livello dell'MCS,ed è fiancheggiato dai promotori di T7 ed SP6. Fin qui non ho perplessità.
Mi sorgono dubbi quando si continua affiancando ai lati di ciascun promotore una sequenza che verrà poi riconosciuta dal frammento del Fago M13 precedentemente purificato(il quale funge da primer...): le sequenze inserite sono già a doppio filamento...perchè dover inserire il frammento di M13?Help me please....grazie a tutti fin d'ora, sono proprio nel pallone!!!!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2009 : 10:51:29
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non so se ho capito bene quello che hai scritto, mi sembra improbabile.
Potresti riscrivere la domanda in maniera più semplice e dettagliata? |
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munincha
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2009 : 11:18:01
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Salve,
l'esperimento consiste nell'impiegare una molecola a doppio filamento di RNA per silenziare il gene dell'occhio in planaria,dimostrando quindi l'attività degli RNA interference.
Per farlo bisogna sintetizzare in vitro prima i singoli filamenti di Rna, uno senso ed uno antisenso,e per fare questo bisogna partire dal gene dell'occhio estratto dal genoma di planaria.
Il gene dell'occhio è inserito all'interno di un plasmide a livello del multiple cloning site(MCS)ed è fiancheggiato da due promotori (sp6 e t7)perchè nella fase successiva di trascrizione si inseriranno in 2 eppendorf separate le polimerasi T7 ed SP6 che avvieranno la trascrizione del gene via senso ed antisenso. Ora, non ho ben capito la funzione del frammento M13 che viene preventivamente isolato ed aggiunto alle singole eppendorf. Dai dati che ho a disposizione, sembra che nel plasmide, ai lati dei promotori che fiancheggiano il gene, sia già presente una sequenza che verrà riconosciuta dal frammento del fago M13,che, in base a quanto è scritto,sembrerebbe fungere da primer.E' proprio qui il problema...
innanzitutto credo che la sequenza riconosciuta((?) piuttosto legata dal frammento M13)dovrebbe essere posta ai lati del gene e non ai lati dei promotori,inoltre la sequenza a disposizione è già a doppio filamento...proprio per questo chiedevo se qualcuno avesse già fatto una esperienza simile e potesse illustrarmi il passaggio che porta alla trascrizione dei due filamenti di RNA (senso in una eppendorf, antisenso nell'altra).
Mi spiace ma non riesco ad essere più semplice nella spiegazione di così...grazie fin d'ora della pazienza e dell'aiuto. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2009 : 13:04:47
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la situazione non è migliorata molto, forse hai un po' di confusione tu oppure sono io che non riesco a capire.
1) sappiamo tutto di che si tratti l'RNA interference
2) capisco che state facendo una sintesi in vitro dei singoli filamenti di sRNA da un vettore utilizzando i promotori sp6 e T7 classici.
3) capisco anche che lo fate in due eppendorf diverse, altrimenti la sintesi di ogni strand comprometterebbe l'elongazione della trascrizione inversa
4) La presenza delle sequenze M13 forward e reverse ai lati esterni delle sequenze T7 e sp6 non mi meraviglia, tantissimi vettori li hanno, servono anche per sequenziare quello che hai clonato nel MCS
5) qui non mi è chiaro 'il frammento di M13' che inserisci, si tratta del primer? del fago? di un enzima per la trascrizione tratto dal fago M13?
Non ho mai fatto la trascrizione in vitro, ma a che mi risulti basta l'RNA polimerasi, il vettore con il promotore giusto, gli NTP e buffer.
M13 l'ho sentito utilizzare per fare delle sonde a sDNA, o per generare dei virus per le infezioni, ma nella trascrizione in vitro, specifico del tuo caso, non avrei idea di cosa possa essere.
6) Che la sequenza a disposizione sia già a doppio strand non è importante, piuttosto è importante che sia l'RNA a doppio filamento. Nella trascrizione, come saprai l'RNA è sintetizzato a singolo filamento. Per l'RNA interference è fondamentale che l'RNA sia a doppio filamento per cui si utilizzano due strategie principalmente, ovvero quella di avere 2 filamenti di RNA che si appaiano da soli, oppure un singolo filamento di RNA che si piega a forcina formando la doppia elica. |
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munincha
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 25 agosto 2009 : 09:28:12
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Quello che non mi era chiaro (quindi la confusione ci sta tutta!) era dato dal fatto che nel plasmide ho già Forward e Reverse affiancati ai promotori,quindi non capisco perchè dover inserire nuovamente un frammento di M13 che funga da PRIMER!
I miei dubbi non erano rivolti ad altro se non a questo "piccolo particolare" che, anche a me sembra poco probabile.
Spero ora di essere stata più esplicativa.
Grazie ancora |
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