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arabidopsis
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 Inserito il - 03 ottobre 2009 : 12:56:23
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Salve a tutti! avrei bisogno di un chiarimento nell'interpretazione dei dati relativi ad un esperimento di perforated patch clamp dell'articolo in allegato. Qualcuno è disposto ad aiutarmi? Ho la tesi tra qualche giorno 
Grazie
Allegato:  recupero del CFTR con il miglustat.pdf
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chick80
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arabidopsis
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6 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2009 : 13:38:26
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ciao chick80! non sono sicura di aver compreso bene le tracce relative alle correnti di Cl- nelle varie condizioni spermentali. Quello che mi viene da dire è che si ha un evidente corrente di Cl- quando le cellule vengono trattate sia con migustat che con fsk+gst; questi grafici di patch clamp sono diversi da quelli utlizzati di solito.
poi un'altra cosa che non ho capito sono gli esperimenti di efflusso di ioduro; perchè vengono effettuati? lo ioduro utilizza sempre il CFTR pr uscire dalla cellula?
grazie! |
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chick80
Moderatore
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11491 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2009 : 15:02:54
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Premetto che non so nulla delle sostanze che usano in questo studio... però posso spiegarti i grafici di patch clamp
Le figg 2A-B-C e D ti fanno vedere i risultati di esperimenti di voltage clamp in cui vengono eseguiti step di voltaggio da -80mV a +80mV e si guarda la corrente risultante.
Il protocollo è lo stesso nei 4 casi, ma sono utilizzate 4 condizioni diverse (37°, bassa T, miglustat e NB-DGJ)
La prima linea è la situazione controllo per le 4 condizioni, la seconda linea la stessa cosa dopo trattamento con forscolina/genisteina e la terza è dopo trattamento con forsc/gen + glibenclamide
Come puoi vedere in condizioni controllo (prima linea) non c'è praticamente passaggio di corrente, se non una piccola corrente a bassa T e con miglustat. Nota che la pipetta contiene Cs per bloccare la corrente Ih (hyperpolarization induced current)
Quando però tratti con forscolina/genisteina, hai un forte aumento della corrente nelle 2 situazioni intermedie (linea centrale), aumento che puoi eliminare trattando con glibenclamide (terza linea)
I 4 grafici in basso fanno vedere la stessa cosa, solo ti mettono sulla x il voltaggio applicato e sulla y la corrente media ottenuta
Come puoi vedere nelle situazioni 2 e 3 è presente una corrente dopo trattamento con forscolina (pallini bianchi).
Per quanto riguarda lo ioduro, immagino sia una cosa fatta artificialmente, ma non ho mai fatto studi su CFTR, non sono sicuro.
Prova a guardare la ref #11, che è quella che citano loro a riguardo di questo test nei materiali e metodi. |
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arabidopsis
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6 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2009 : 15:44:56
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Ma grazieeeeeee!!!
quindi le tracce corrispondono ai vari step di voltaggio e ad ogni step il voltaggio aumenta di 20 mV...il problema di fondo lo sai qual'è? che non ho capito bene diversi aspetti del patch clamp, tipo il blocco della corrente e l'utilizzo dell'antibiotico per la formazione di canali ionici non selettivi...sono un po' confusa... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2009 : 16:42:06
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Lo spiegavo un po' qui:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=2153
Per quanto riguarda gli antibiotici: l'idea è che quando fai del patch clamp whole cell praticamente fai un buco nella membrana per poter misurare il potenziale di membrana (vedi l'immagine verso metà pagina qui: http://en.wikipedia.org/wiki/Patch_clamp ). Questo ha il grosso svantaggio di diluire fortemente il contenuto cellulare con il contenuto della pipetta; benchè questo possa essere utile in alcune situazioni (es. quando vuoi imporre determinate [] di ioni all'interno della cellula) può essere sconveniente in altre situazioni (es. quando vuoi studiare l'attività della cellula nel suo stato "normale"). Puoi quindi usare la tecnica del perforated patch in cui usi un antibiotico che fa dei piccoli pori in membrana. In questo modo l'elettrodo è effettivamente in contatto elettrico con l'interno della cellula, e quindi puoi misurare (e/o controllare) il potenziale di membrana, tuttavia l'effetto di diluizione è minimo mantenendo quindi il normale milieau intracellulare. |
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arabidopsis
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6 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2009 : 17:48:28
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Sei stato chiarissimo...grazie davvero!
quindi quando viene applicato un voltaggio negativo il Cl- viene trasportato all'esterno, mentre quando il voltaggio è positivo viene trasportato all'interno; deduco anche che il canale CFTR non è del tipo rectifying perchè la relazione I/V è rappresentata da una retta.
Ho capito anche a cosa servono gli esperimenti di flusso di ioduro: il CFTR è in grado di trasportare anche I-, questo consente di utilizzare l'isotopo radioattivo I125; l'analisi del segnale radioattivo consente di saggiare la funzionalità del canale.
grazie ancora  |
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16 Messaggi |
Inserito il - 23 dicembre 2009 : 15:54:41
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ciao a tutti, riprendo questo topic per avere un chiarimento riguardo l'analisi dei dati del patch clamp, in particolare su cosa ci permettono di studiare i protocolli "a rampa" e "a step" (spero siano i termini tecnici giusti) in configurazione whole cell, ovvero se si vanno a osservare caratteristiche specifiche di una cellula, o semplicemente la sua attività elettrica.
Inoltre volevo sapere cosa si può dire di una cellula che, sempre in whole cell e in seguito all'applicazione di un protocollo "a step" (da -100 a + 60 mV), ha un grafico IV che è una retta passante per l'origine (quindi passa da valori negativi a positivi intersecando l'asse delle ascisse al valore 0). Da qualche parte mi pare di aver letto che è una cellula elettricamente passiva perchè ha canali con comportamento di tipo ohmico però, se non sbaglio, la curva IV ha valori negativi se la corrente è in ingresso, e valori positivi se la corrente è in uscita dalla cellula, quindi dovrebbe trattarsi di una cellula che è in grado di avere variazioni del proprio potenziale di membrana, o no?!?!?!?
(spero di essere riuscito a spiegarmi, altrimenti provo a cercare qualche esempio di grafico in rete...) |
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interpretazione dati perforated 
