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D. Melanogaster
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 Inserito il - 07 luglio 2015 : 03:58:14
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Ciao! Provo a spiegartelo!
Come ben saprai l'insulina ha due catene (alpha e beta).
Inizialmente, si sono prodotte le due catene separatamente mediante un clonaggio in E. coli, utilizzando due oligo di sintesi che rispecchiano le triplette degli aa. Il problema era che queste catene, prese singolarmente, avevano un PM molto basso, coli le riconosceva come virali e le degradava.
Allora hanno cambiato approccio.
Hanno clonato una delle due catene (mettiamo la alpha) a valle del gene che codifica per la beta-galattosidasi (lasciando quindi il promotore Lac, Shine-Dalgarno, sequenza segnale e buona parte della sequenza del gene della beta-gal.). Il DNA clonato era di sintesi. Tra il gene della beta-gal e quello della catena alpha hanno inserito una Met, riconosciuta dal bromuro di cianogeno. Il bromuro di cianogeno taglia a valle della Met e mi permette di recuperare la catena alpha dal proteinone sintetizzato dal batterio.
Si rifà tutta la trafila per la catena beta, dopodiché di pongono le catene in condizioni ossidanti per ottenere l'insulina stabilizzata dai ponti disolfuro. Il problema era che così c'erano 2 processi fermentativi, 2 processi di downstream... tutto in doppio per ottenere entrambe le catene e il tutto veniva a costare parecchio.
PROCESSO ALTERNATIVO
Tramite screening delle banche, hanno scoperto quale fosse il gene umano che codificava per la pre-pro-proteina. Usando la catena alpha o beta come sonda, hanno ricavato il cDNA. Quindi:
1) hanno identificato la sequenza segnale;
2) hanno recuperato la sequenza che codifica per la pro-insulina (senza sequenza segnale);
3) hanno excisso il peptide C con tripsina, ottenendo dalla pro-proteina l'insulina matura correttamente foldata;
4) hanno clonato il cDNA dell'insulina.
In questo modo c'era un solo clonaggio, una sola fermentazione ed un solo downstream.
Il plasmide sarà lo stesso di prima (promotore Lac, quasi tutto il gene della beta-gal, Met come sito di taglio) solo che a valle ci clono il cDNA della insulina matura e non più di una sola catena!
In seguito, per facilitare il downstream, si è inserito un vero e proprio tag (il dominio ZZ) al posto del gene della beta-gal. Quindi, la nuova struttura era questa:
ZZ -- Arg-Lys -- cDNA
Il dominio ZZ riconosce le IgG --> faccio una cromatografia di affinità che mi permette una maggiore efficienza di purificazione.
La tripsina, invece, mi permette di eliminare il tag dopo la cromatografia perché taglia a valle delle Arg-Lys.
Quindi, ricapitolando:
1) mi faccio la fermentazione (biomassa di E. coli + produzione di proteina ricombinante);
2) Rompo le cellule e recupero i corpi di inclusione (oppure faccio secrezione periplasmatica, mettendo la sequenza segnale di coli a monte del dominio ZZ);
3) step di solubilizzazone e rinaturazione;
4) cromatografia di affinità mediante IgG;
5) processamento enzimatico con tripsina (elimino il tag);
6) cromatografia di affinità per rimuovere il tag.
Spero di esserti stata d'aiuto. Resto comunque a disposizione per eventuali chiarimenti (sperando di essere in grado di darteli). Ah, se ho scritto qualche castroneria, correggetemi!
P.S. Il dominio ZZ è di una proteina Stafilococcica.
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