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vice05
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
14 Messaggi |
 Inserito il - 01 marzo 2008 : 20:58:04
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ciao, dovrei fare una relazione sulla pcr real time, in laboratorio sto facendo esclusivamente pcr classiche e retrotrascrizioni, ma con la real time in sè non mi sono mai cimentato. Ho cercato già sul forum e in vari siti ma mi rimane comunque il dubbio. naturalmente con la quantificazione assoluta riesco ad avere la concentrazione del prodotto utilizzando uno standard di cui conosco già la concentrazione e di cui se non ho capito male si fanno diluizioni successive (come?) e su costruisce una curva standard. mentre con la relativa si osserva quanto un gene è espresso per esempio in un tessuto rispetto ad un altro ( o no?) senza avere un valore numerico della mia espressione ma si confrontano solo i due Ct. in tutto questo si è parlato anche di geni housekeeping e controlli endogeni...cioè?
mi chiarite la cosa  
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2008 : 22:58:25
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Un gene housekeeping è un gene che viene normalmente espresso da una cellula e generalmente a livelli medio-alti.
Per usarlo come controllo endogeno (o standard interno) in una realtime la sua espressione deve essere costante.
Quindi se tu hai controlli e trattati il tuo housekeeping dovrà essere in media lo stesso nei due gruppi, mentre il tuo gene di interesse potrà (o meno) essere influenzato dal trattamento.
Quando analizzi i Ct li riporti al tuo gene housekeeping (calcolando il delta Ct = Ct(housek) - Ct(gene X) ) e in questo modo elimini la variabilità dovuta al fatto di avere più o meno RNA totale nel campione.
Esempi di housekeeping sono l'RNA ribosomiale 18S o l'actina o la beta tubulina.
Vedi anche:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1423
La curva standard la fai partendo da RNA a concentrazione nota e diluendolo mano a mano di un numero di volte noto. |
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vice05
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
14 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2008 : 23:11:08
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| se ho capito bene, quindi il confronto con l'housekeeping lo si fa solo nella quantificazione relativa ed in particolare si ricava quanto il gene x è più o meno espresso nel trattato rispetto al controllo eliminando la variabilità grazie alla "normalizzazione" delle Ct col gene housekeeping mentre nella quantificazione assoluta si costruisce solo la curva standard tramite la diluizione di un controllo a concentrazione nota e poi a secondo di dove c'ho la mia amplificazione allora il campiono avrà una concentrazione di X ng. dico bene? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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vice05
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
14 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2008 : 01:16:14
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| grazie ancora chick, un saluto a tutti Vincenzo |
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alexius100
Nuovo Arrivato
Prov.: Firenze
Città: Firenze
6 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2008 : 11:04:16
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Scusatemi ho da porvi una domanda.
Nel caso io voglia effettuare una quantificazione assoluta io devo usare uno standard ed eseguire diluizioni successive e crearmi così la mia curva standard. La domanda è: il mio standard può essere un gene diverso da quello di cui io voglio calcolarmi la concentrazione iniziale?
Spero di essere stato chiaro e vi ringrazio.
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Ale |
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mrgorefest
Nuovo Arrivato
Prov.: BA
Città: Bari
9 Messaggi |
Inserito il - 28 dicembre 2009 : 08:04:21
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supponendo che io voglia fare una quantificazione assoluta di un virus ad RNA(ad es. un flaviviridae) con Real-Time RT-PCR.
come costruisco lo standard? |
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Saw
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 14 dicembre 2011 : 17:40:57
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| ok èer lo standard interno ma il calibratore cos'è? |
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