Quantificazione relativa e assoluta in real time

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vice05
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Citt�: Roma

14 Messaggi

Inserito il - 01 marzo 2008 : 20:58:04

ciao, dovrei fare una relazione sulla pcr real time, in laboratorio sto facendo esclusivamente pcr classiche e retrotrascrizioni, ma con la real time in s� non mi sono mai cimentato. Ho cercato gi� sul forum e in vari siti ma mi rimane comunque il dubbio. naturalmente con la quantificazione assoluta riesco ad avere la concentrazione del prodotto utilizzando uno standard di cui conosco gi� la concentrazione e di cui se non ho capito male si fanno diluizioni successive (come?) e su costruisce una curva standard. mentre con la relativa si osserva quanto un gene � espresso per esempio in un tessuto rispetto ad un altro ( o no?) senza avere un valore numerico della mia espressione ma si confrontano solo i due Ct. in tutto questo si � parlato anche di geni housekeeping e controlli endogeni...cio�?
mi chiarite la cosa

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 01 marzo 2008 : 22:58:25

Un gene housekeeping � un gene che viene normalmente espresso da una cellula e generalmente a livelli medio-alti.
Per usarlo come controllo endogeno (o standard interno) in una realtime la sua espressione deve essere costante.

Quindi se tu hai controlli e trattati il tuo housekeeping dovr� essere in media lo stesso nei due gruppi, mentre il tuo gene di interesse potr� (o meno) essere influenzato dal trattamento.
Quando analizzi i Ct li riporti al tuo gene housekeeping (calcolando il delta Ct = Ct(housek) - Ct(gene X) ) e in questo modo elimini la variabilit� dovuta al fatto di avere pi� o meno RNA totale nel campione.

Esempi di housekeeping sono l'RNA ribosomiale 18S o l'actina o la beta tubulina.
Vedi anche:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1423

La curva standard la fai partendo da RNA a concentrazione nota e diluendolo mano a mano di un numero di volte noto.

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vice05
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Citt�: Roma

14 Messaggi

Inserito il - 01 marzo 2008 : 23:11:08

se ho capito bene, quindi il confronto con l'housekeeping lo si fa solo nella quantificazione relativa ed in particolare si ricava quanto il gene x � pi� o meno espresso nel trattato rispetto al controllo eliminando la variabilit� grazie alla "normalizzazione" delle Ct col gene housekeeping mentre nella quantificazione assoluta si costruisce solo la curva standard tramite la diluizione di un controllo a concentrazione nota e poi a secondo di dove c'ho la mia amplificazione allora il campiono avr� una concentrazione di X ng. dico bene?

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 01 marzo 2008 : 23:52:50

S�, esatto.

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vice05
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Citt�: Roma

14 Messaggi

Inserito il - 02 marzo 2008 : 01:16:14

grazie ancora chick, un saluto a tutti Vincenzo

alexius100
Nuovo Arrivato

Prov.: Firenze
Citt�: Firenze

6 Messaggi

Inserito il - 06 maggio 2008 : 11:04:16

Scusatemi ho da porvi una domanda.
Nel caso io voglia effettuare una quantificazione assoluta io devo usare uno standard ed eseguire diluizioni successive e crearmi cos� la mia curva standard. La domanda �: il mio standard pu� essere un gene diverso da quello di cui io voglio calcolarmi la concentrazione iniziale?
Spero di essere stato chiaro e vi ringrazio.
Ale

Ale

mrgorefest
Nuovo Arrivato

Prov.: BA
Citt�: Bari

9 Messaggi

Inserito il - 28 dicembre 2009 : 08:04:21

supponendo che io voglia fare una quantificazione assoluta di un virus ad RNA(ad es. un flaviviridae) con Real-Time RT-PCR.
come costruisco lo standard?

Saw
Nuovo Arrivato

8 Messaggi

Inserito il - 14 dicembre 2011 : 17:40:57

ok �er lo standard interno ma il calibratore cos'�?

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