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Mrs.who
Nuovo Arrivato

13 Messaggi

Inserito il - 05 marzo 2018 : 22:56:02

Buonasera a tutti, vorrei chiedervi un aiuto.
Perchè in una RT-PCR real time che utilizza un probe costituito da FAM-Quencher c'è bisogno di inserire nella mix anche il ROX?
Cioè, se si utilizza una sonda per avere più specificità ed evitare di utilizzare semplici fluorofori che si legherebbero con specificità minore e anche ai primers, perchè utilizzare entrambi?
Nel grafico finale le diverse curve non sono attribuibili solamente alla fluorescenza della sonda?
Scusate sembrerà una domanda stupida ma non trovo nessuno che me la risolva.
Grazie a tutti!!!

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 09 marzo 2018 : 17:36:44

La funzione di ROX è quella di normalizzare, è un colorante fluorescente inerte, non partecipa alla reazione ma viene rivelato dallo strumento. La sua fluorescenza "dovrebbe" essere uguale in ogni pozzetto (perché ce n'è la stessa quantità), ma per vari motivi (errori) può essere letta in modo diverso nei diversi pozzetti, quindi normalizzando la fluorescenza del reporter rispetto la fluorescenza di ROX ottieni un valore corretto e più esatto.

Comunque in questo video è spiegato bene:
https://www.youtube.com/watch?v=qq0l_wyhFZo

Mrs.who
Nuovo Arrivato

13 Messaggi

Inserito il - 11 marzo 2018 : 14:59:28

Grazie infinite GFPina, davvero gentilissima!!!