problema saggio delle placche su cellule VERO

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Thommy83
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 16 ottobre 2008 : 20:42:32

Ciao a tutti, sono un nuovo utente!
Volevo chiedere il vostro aiuto in quanto ho qualche problema nel mettere a punto un saggio delle placche su cellule VERO con il virus V41 (un herpes virus+GFP).
Allora io eseguo l'infezione normalmente con le varie diluizioni seriali del virus in una piastra da 24 pozzetti, poi dopo qualche giorno procedo con la fissazione mediante una soluzione costituita da 2 parti di metanolo e 1 parte di acetone per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovo quindi tale soluzione e per ogni pozzetto aggiungo 300 microlitri di cristalvioletto e lascio il tutto sempre a temperatura ambiente per 1 ora. Poi per� quando vado a rimuovere il cristalvioletto con acqua deionizzata..le cellule praticamente si staccano e rimango con i pozzetti vuoti.
Qualcuno sa per caso quale potrebbe essere il problema? Lo stesso protocollo per i fibroblasti MRC5 funziona benissimo.
E' sbagliata la procedura di fissazione?
Grazie mille a tutti

Giuliano652
Moderatore

Prov.: Brescia

6941 Messaggi

Inserito il - 16 ottobre 2008 : 21:07:28

Uhm... troppo virus?

In ogni caso vedi se il protocollo che c'� qui sul sito pu� aiutarti

http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=50

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Eziad
Nuovo Arrivato

Prov.: Napoli
Citt�: Napoli

36 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2008 : 20:09:18

io uso la fissazione in formaldeide................

Eziad

mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato

116 Messaggi

Inserito il - 30 ottobre 2008 : 08:54:49

anche io uso la fissazione in formaldeide...piu precisamente per human hepatoma cells le fisso con paraforlmaldeide 3% in PBS per 30 minuti (sciogliere scaldando). poi lavo 3 volte con PBS e lascio le cellule in PBS con 50mM di glicina per 30 minuti per allontanare la p-formaldeide rimasta. vedi te se pu� esserti di aiuto. ciao