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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
 Inserito il - 25 settembre 2012 : 17:16:20
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Sto provando a trasfettare delle cellule con un siRNA verso la proteina che voglio studiare. Per essere sicuro che la trasfezione del siRNA sta avvenendo vorrei portarmi un controllo positivo. Le company ne forniscono molti da acquistare (a caro prezzo), ma non mi danno la sequenza (ovviamente).
Qualcuno ha la sequenza di un siRNA verso un controllo positivo, così posso farlo sintetizzare? Tipo GAPDH o cose così?!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2012 : 20:15:26
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| ma se e' un controllo solo per la trasfezione, non potresti fare un siRNA per GFP (che trasfetti insieme al siRNA anti-GFP)? |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2012 : 08:40:30
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| beh si dovresti trasfettare anche la gfp... forse così è + complicato però era solo una idea. Se vuoi un controllo positivo endogeno, puoi usare gapdh come tu stesso hai detto; magari trovi la sequenza in letteratura no? hai cercato? In ogni caso, c'è differenza in termini di costo tra comprarlo già sintetizzato dalla company oppure fornire la sequenza e farlo sintetizzare? |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2012 : 09:22:15
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
magari trovi la sequenza in letteratura no? hai cercato? In ogni caso, c'è differenza in termini di costo tra comprarlo già sintetizzato dalla company oppure fornire la sequenza e farlo sintetizzare?
Ho cercato in letteratura ma non l'ho (ancora) trovato. Sintetizzarlo costa una 60ina di €, comprarlo almeno il doppio... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2012 : 10:43:05
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forse non ho capito bene, ma io non spenderei in un controllo di trasfezione del siRNA. Mi spiego, come controllo puoi usare uno scramble, ma per vedere l'efficacia del silenziamento (e quindi, ancora più a monte, l'efficacia della trasfezione) ti basta il wb della proteina a 12, 24, 48 e 72h come inizio. Se in parallelo ti trasfetti un siRNA per qualsiasi altra cosa (GAPDH, GFP o mostri vari), chi ti dice che l'efficienza di trasfezione del siRNA controllo sia uguale a quella del siRNA di interesse? E chi ti dice che il silenziamento di GAPDH (o chi per essa) non sia talmente tossico da ucciderti le cellule? In questo caso l'efficienza è imparagonabile.
che ne pensi? |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2012 : 12:12:23
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Domi ma la domanda principale è: "a cosa ti serve questo controllo?"
Ovviamente ogni controllo è diverso in base allo scopo per cui si usa, - un controllo scrambled come suggerisce Iside è un controllo negativo che ti serve per dimostrare che gli effetti che vedi siano dovuti effettivamente al silenziamento del tuo gene e non ad altro
- un controllo fatto con un siRNA contro un gene HK ti serve come controllo positivo per valutare che tutte le condizioni del tuo esperimento siano ottimali e che stia funzionando il silenziamento (ovviamente con tutte le restrizioni del caso, dato che non è detto che l'efficienza di silenziamento del controllo e del tuo gene siano uguali)
- un controllo di trasfezione invece generalmente è banalmente una sostanza fluorescente che ti permette osservando al microscopio qual è l'efficienza di trasfezione.
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2012 : 12:35:03
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Evidentemente non mi sono spiegato. Mi impegnerò questa volta!
Devo trasfettare queste cellule particolamente restie alla trasfezione  (MEF). Sto usando questa interferin (tipo di lipofectamine, tanto per capirci) con un sirna (pubblicato su un lavoro) per la mia proteina di interesse. Dal WB non vedo diminuire la proteina e non so se è il sirna che non va bene, o è la trasfezione che non ha successo.
Citazione:
Se in parallelo ti trasfetti un siRNA per qualsiasi altra cosa (GAPDH, GFP o mostri vari), chi ti dice che l'efficienza di trasfezione del siRNA controllo sia uguale a quella del siRNA di interesse? E chi ti dice che il silenziamento di GAPDH (o chi per essa) non sia talmente tossico da ucciderti le cellule? In questo caso l'efficienza è imparagonabile.
che ne pensi?
Non mi interessa sapere esattamente l'efficienza di trasfezione, mi interessa soltanto sapere se la tecnica funziona (visto che è la prima volta che la faccio)
Citazione:
un controllo fatto con un siRNA contro un gene HK ti serve come controllo positivo per valutare che tutte le condizioni del tuo esperimento siano ottimali e che stia funzionando il silenziamento (ovviamente con tutte le restrizioni del caso, dato che non è detto che l'efficienza di silenziamento del controllo e del tuo gene siano uguali)
è proprio questo quello che mi serve...
(ovviamente porto come controllo negativo lo scrambled...ma non è questo il mio problema ora) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2012 : 13:12:24
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Ok, in effetti mi sembrava che fosse quello che chiedevi, ma anche visto le successive risposte meglio essere sicuri! 
In ogni caso, io una sequenza di un siRNA per un HK non ce l'ho.
E' vero che prenderlo già fatto costa di più ma sono siRNA testati e garantiti, fai attenzione che uno disegnato da te (o preso da qualcuno) non è detto che funzioni allo stesso modo.
In ogni caso un controllo di trasfezione ti conviene comunque utilizzarlo, a maggior ragione se è la prima volta che transfetti quelle cellule e usi quella sostanza.
Poi per la sequenza del controllo positivo, mi spiace ma purtroppo non posso aiutarti e posso solo consigliarti di continuare a controllare in letteratura.
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
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Controllo positivo 
Didattica e Relazioni
Inserito il - 26 settembre 2012 : 06:55:45
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