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Fiammella85
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 27 gennaio 2008 : 14:50:07
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Gentili utenti, sono nuova, è la prima volta che entro in questo forum. Volevo porvi alcune domande. Sto scrivendo la tesi triennale e volevo chiedervi un aiuto. La mia tesi parla della traslocazione della proteina HSPC038 in membrana durante la stimolzione ipotonica.
Le domande sono:
1-Perche´trasfettiamo le cellule con HSPC038?
2-Perche´usiamo l'anti -FLAG
3-A cosa ti serve utilizzare la Na-K-Atpasi?
4-Perche´si usano gli inibitori delle proteasi nel buffer di lisi?
5-Cosa avviene nelle reazione di sviluppo del western blot?
6-A cosa serve lavare con il TBST? Che differenza esiste tra TBS e TBST?
Ringrazio subito chi mi risponderà.
A presto.
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2008 : 15:13:26
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ciao fiammella85, alle prime 3 domande non saprei risponderti, bisognerebbe capire bene di cosa parli nella tesi.
per quanto riguarda le altre domande, provo ad aiutarti in modo più semplice possibile:
4) se tu usi un qualsiasi buffer di lisi senza inibitori delle proteasi, il risultato è che le tue proteine saranno degradate ad opera delle proteasi. se invece, inibisci le proteasi eviti la degradazione. esistono tante proteasi che puoi usare in un buffer di lisi, ed esistono anche delle pasticche commerciali che vengono definite cocktail di inibitori delle proteasi, perchè contengono inibitori specifici per vari tipi di proteasi.
5)allora, mettiamo che hai fatto un western: hai lisato le cellule, hai raccolto le proteine, le hai doate, hai corso i campioni, li hai trasferiti su filtro, hai incubato con l'anticorpo I e poi con il II...a questo punto usi un substrato che si leghi ad un enzima coniugato con l'anticorpo II e, a seguito di questo legame, si avrà una reazione, come ad esempio una reazione di chemilumescenza. mettendo a contatto il filtro con una lastra, il segnale di chemiluminescenza impressiona la lastra nel punto specifico in cui è presente la tua proteina che ha legato l'anticorpo I prima, e quello secondario poi.
6) il TBST è Tris-buffered saline tween 20. è una soluzione salina che contiene il tween, un detergente. viene usata nei lavaggi dei filtri, ad esempio, dopo aver incubato con i vari anticorpi si procede sempre con i lavaggi per eliminare l'eccesso di anticorpo non legato, o anche, dopo avere eseguito il blocking. il TBS è senza tween.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2008 : 16:13:00
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| Scusa ma...il perchè di quello che hai fatto lo dovresti sapere tu,come facciamo a saperlo noi che non sappiamo nulla del tuo lavoro?In fondo lo scopo della tesi dovrebbe essere questo no? |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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vega
Nuovo Arrivato
Prov.: catania
Città: catania
8 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2008 : 14:53:58
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sono assolutamente d'accordo con gabriele....più che altro dovresti chiederlo a chi ti ha seguito.
Cmq, immagino che utilizzi l'anti-flag sicuramente perchè ciò che trasfetti ha come tag appunto il flag, per cui per discriminare tra l'endogeno e l'ectopico utilizzi un anticorpo che "vede" solo uno dei due. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2008 : 23:06:36
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Citazione:
1-Perche´trasfettiamo le cellule con HSPC038?
Non credi di aver risposto tu stessa alla domanda 1?
Citazione:
La mia tesi parla della traslocazione della proteina HSPC038 in membrana durante la stimolzione ipotonica.
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NEMAZANCHI
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 29 gennaio 2008 : 12:51:36
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Qualcuno sa quali tecniche possono essere impiegate per lo studio dell'espressione proteica in un sistema cellulare? |
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