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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
 Inserito il - 12 febbraio 2009 : 13:45:25
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ciao devo tasferire una proteina di 290 kd e poco rappresentata, mi sapete indicare per quanto empo e a che voltaggio devo trasferire il gel su nitro? grazie
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Ricciola
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2009 : 14:02:29
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io ti consiglio di fare il trasferimento per 2 ore a 60volt in ghiaccio; nel tampone di trasferimento puoi anche mettere del metanolo che aiuta il trasferimento delle proteine più grandi (io faccio per 1 litro di tampone:
100 ml di madre tris Gly 10X
10ml SDS 10%
200 ml di metanolo
volume con H2O milliq |
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2009 : 15:05:17
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| secondo me è troppo poco 60 volt. almeno 110 volt per lo stesso tempo. usa un marker dello stesso peso per vedere il trasferimento. ok per il buffer |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Ricciola
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2009 : 15:42:39
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| a me con 60V il trasferimento viene bene, 100-120 V si addicono di più ad un tempo di un'ora, secondo la mia esperienza |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2009 : 12:51:13
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grazie speriamo...
una seconda domanda...nel caso non dovessi vedere nulla nonostante il tempo di trasferimento. la mancanza della proteina (ripeto è una proteina di segnale poco rappresentata) puo essere causata dal fatto che non faccio bollire i campioni lisati? ma faccio lisi in ghiaccio? grazie |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2009 : 13:04:05
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| Gli anticorpi per Western generalmente riconoscono la proteina denaturata. Conviene bollire i campioni prima di caricarli. |
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2009 : 13:16:49
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| i miei campioni sono in SDS e b mercapto.... non è abbastanza dici? conviene farli bollire..ma per quanto? |
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Ricciola
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2009 : 15:44:14
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| sono d'accordo con chick80, io li tengo 5 minuti a 100 gradi C prima di caricarli |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2009 : 16:18:36
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Concordo anche io sulla denaturazione delle proteine prima della corsa nel Poliacrilamide
Citazione:
Ricciola Inserito il - 13 febbraio 2009 : 15:44:14
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sono d'accordo con chick80, io li tengo 5 minuti a 100 gradi C prima di caricarli
jeje Inserito il - 13 febbraio 2009 : 13:16:49
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Gli anticorpi per Western generalmente riconoscono la proteina denaturata. Conviene bollire i campioni prima di caricarli.
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www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2009 : 16:45:17
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| grazie!provo |
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2009 : 18:00:10
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| problema di porosita di membrana? |
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2009 : 12:56:43
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secondo voi devo controllare i pori della membrana? nel catagolo non sono indicati...è meglio usare PDVf per grandi proteine?
grazie |
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2009 : 13:43:57
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| senz'altro fai bollire i campioni. per essere sicura del blottaggio usa un marker che abbia una banda a 290 e vedi se blotta. se si vai con la tua proteina |
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2009 : 14:50:33
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| grazie ti faro sapere.. |
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2009 : 18:20:53
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| nn si vede niente!!!!!ma puo essere che la banda io nn la veda mai ad occhio nudo? |
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2009 : 14:30:21
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Potresti provare:
Gel 6% (se non lo usi già)
Trasferimento overnight a freddo 35 mA costanti in towbin (25 mM tris 192 mM glicina metoh 20%) + sds 0.1%
Per me funziona...
Ciao |
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2009 : 15:30:35
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RM ho appena sentito una persona che mi ha confidato che aggiungere SDS al tampone di transferimento per proteine ad alto peso molecolare è fondamentale!!!!!!!!!!
speriamo grazie |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2009 : 15:58:24
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Citazione:
Messaggio inserito da jeje
RM ho appena sentito una persona che mi ha confidato che aggiungere SDS al tampone di transferimento per proteine ad alto peso molecolare è fondamentale!!!!!!!!!!
speriamo grazie
Si infatti stavo per dirti la stessa cosa!
Per proteine ad alto peso molecolare SDS e NO metanolo!!!
Citazione:
Messaggio inserito da Ricciola
... nel tampone di trasferimento puoi anche mettere del metanolo che aiuta il trasferimento delle proteine più grandi
Come ho già detto in un'altra discussione, questo è assolutamente falso!!! Il metanolo fa staccare l'SDS dalle proteine e interferisce con il trasferimento di proteine ad alto peso molecolare, al contrario l'SDS lo favorisce. Il metanolo va bene per proteine a basso peso molecolare.
Se usi membrane di PVDF il metanolo è importante per aumentare il legame delle proteine alla membrana, ma non è necessario metterlo nel buffer di trasferimento, l'importante è attivare la membrana di PVDF con un breve passaggio in metanolo (1 min) prima dell'utilizzo. Poi, eventualmente sciacquarla in acqua, ed equilibrarla nel tampone di trasferimento.
Per il resto come ti hanno detto, meglio un blotting lungo, possibilmente a 4°C (camera fredda o in ghiaccio).
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2009 : 12:21:27
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| grazie a tutti! |
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