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Flap
Utente Junior
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 Inserito il - 18 maggio 2008 : 17:57:48
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Raga, sto riguardando un esperimento che ho visto fare un po di tempo fa ma mi sa che me ne sono persa un pezzo.
Stiamo parlando del VSV virus ( m.o.i.=o,5). Fai avvenire l' infezione delle cellule contenute in una p100 per 1h a 37C. Poi aggiungi il mezzo di coltura + FCS al 5% con HEPES como controllo e con HEPES + NH4Cl e lasci in incubazione per altre 7h. Dunque congeli per bloccare l' infezione e dopo congeli e descongeli varie volte per lisare le cellule. A questo punto titoli su cellule BHK-21 e conti il numero delle placche di lisi generate alle varie diliuzioni per calcolarti il titolo virale. Si osserva che non ci sono placche dove l' infezione è avvenuta in presenza di NH4Cl e invece ci sono nel controllo.
Ma a cosa mi è servito lisare le cellule? E poi è possibile che aggiungo il siero e il mezzo di coltura dopo il virus? Che cos'è HEPES?
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 18 maggio 2008 : 18:37:33
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Quindi inizialmente utilizzo quanto virus? Mi seve a qualcosa sapere la m.o.i.di VSV per l'assorbimento? Cioè voglio dire che le infezioni sono due: quella per ottenere una grande quantità di virus con la lisi forzata delle cellule e l' infezione vera e propria con il conteggio delle placche di lisi. Quindi la prima infezione serve solo ad aumentare la progenie virale o ha un altro significato?
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Giuliano652
Moderatore
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 18 maggio 2008 : 20:04:37
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Adesso ho capito..la prima infezione mi serve a far produrre il virus nel controllo e nel trattato con ammonio. Poi titolo su altre cellule e mi rendo conto che il titolo virale è alto nel controllo mentre il trattato non ha prodotto placche. Cmq.grazie, il tuo suggermento mi è stato fondamentale per capire l'esperimento.
Ma per caso sei esperto anche in colture cellulari? Io ho qualke problema con i passaggi. Cioè ad esempio avendo una p60 con diluizione 1:4( 6mldi sospensione cellulare in 30 ml) e volendo passare le cellule in un'altra p60 con diluizione di 1:6 e in una p35 con diluizione 1:4...come faccio? Qual'è il ragionamento? Grazie. |
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2008 : 20:11:56
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| No..mi hanno chiesto cosa sono le p100, p60 e le p35. Quindi non credo che possano rispondere alla mia domanda. Tu per caso facevi le colture cellulari attraverso questo tipo di piastre? Io ho fatto un tirocinio a Madrid in virologia anni fa e utilizzavano queste piastre per le colture. Mi sta venendo il dubbio che in Italia non si usino queste. |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2008 : 20:13:06
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| No..mi hanno chiesto cosa sono le p100, p60 e le p35. Quindi non credo che possano rispondere alla mia domanda. Tu per caso facevi le colture cellulari attraverso questo tipo di piastre? Io ho fatto un tirocinio a Madrid in virologia anni fa e utilizzavano queste piastre per le colture. Mi sta venendo il dubbio che in Italia non si usino queste. |
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
6941 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2008 : 16:47:33
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No, usavo flask T25, T75 e T175, ma non credo che la cosa sia tanto diversa, sempre che per 100, 60 e 35 si identifichino le aree della piastra su cui si coltivano le cellule. Se sono le piastre da 3.5, 6 e 10 cm di diametro allora ho capito a cosa ti riferisci. Faccio finta che è così, in questo caso l'area della p35 è 9.6 cmq, della p60 è 28.26 cmq e della p100 è 78.5, da cui i rapporti di circa 1:3 tra p35 e p60 e tra p60 e p100
Prima di tutto la diluizione iniziale non è 1:4 ma 1:5, perché 6 ml di cellule in 30 ml totali vuol dire 1 parte di cellule PIU' 4 di terreno, quindi in totale 5.
Se le cellule crescono in sospensione la cosa è banale: ne prendi 1/4 e 1/6 e le metti dove vuoi, con quanto terreno vuoi (o puoi) Se crescono in monostrato invece devi stare attento all'area.
Passare da una p60 ad un'altra è banale: quando spezzi (splitti, tripsinizzi... come dici tu ? le ho sentite tutte) le cellule le risospendi in un volume facile da dividere per sei (6 ml, ad esempio), ne prendi 1/3 e quello lo piastri nell'altra piastra, aggiungendo terreno e siero Q.B. (come si dice nei libri di cucina). Per passare ad una piastra più piccola, ad esempio da p60 a p35, invece devi prima dividere per il rapporto tra le aree.
Tripsinizzi, risospendi in terreno in una quantità comoda, tipo i soliti 6 ml. Prendendone 1/3 tu avresti il numero sufficiente di cellule da piastrare per farle arrivare subito a confluenza (perché l'area è di un terzo più piccola), quindi per il tuo scopo devi ulteriormente dividere. Per spezzare 1:4 da p60 a p35:
tripsinizzi, risospendi in 6 ml e dividi per 12 (prima dividi per 3 e poi per 4), quindi prendi 0,5 ml e piastri quelli. |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2008 : 19:05:15
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| Ok..hai centrato il discorso. Quindi io ho una p100 con il suo monostrato già arrivato a confluenza e ho bisogno di passarlo. Quindi aspiro il mezzo di crescita e faccio un paio di lavaggi in PBS. Poi tripsinizzo e mi assicuro che le cellule si siano staccate. Qui ti faccio una domanda troppo stupida ma meglio farla a te che alla prof..Quando dici risospendi intendi nel mezzo di crescita, no? Quando io aspiro la tripsina non mi porto via pure le cellule? Oppure semplicemente aspiro la tripsina, le cellule rimangono nella piastra e risospendo nel mezzo di crescita ( FCS, no? )?Grazie per avermi fatto capire quel discorso delle proporzioni che ci stavo impazzendo. Per caso hai qualke consiglio da darmi per una studentessa che vorrebbe la tesi in virologia e a cui la prof ha chiesto di fare una settimana di prova? |
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
6941 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2008 : 20:59:57
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Parto dalla fine: questo genere di consigli non chiederli a me, che è stato un miracolo se non ci siamo picchiati io e la mia proffa 
Dunque, come passare le cellule.
Aspiri il terreno, lavi e metti la tripsina. Questa deve rimanere quanto basta, né di più né di meno, e il tempo è molto variabile a seconda delle cellule (le MDCK le puoi lasciare in tripsina e andarti a fare un caffè nel frattempo, ho visto cellule che invece appena vedevano la tripsina si staccavano). Per quanto riguarda il discorso "togliere la tripsina" mi sono imbattuto in varie scuole di pensiero: c'è chi la lascia direttamente lì, perché tanto poi il siero la inattiva, c'è chi invece aspira la tripsina prima di rompere il monostrato. In ogni caso si prende la piastra, si aspira quasi tutta la tripsina se vuoi toglierla e se ne lascia un goccetto, e si tirano sonore sberle al lato della piastra (se è piccola, sonore ditate) per far staccare le cellule. Con la trispina residua fai in modo di passare su tutta la piastra, muovendola, in modo da raccogliere le cellule. Dopo di questo si mette terreno senza siero (per evitare di disattivare la tripsina, così mentre spipetti raccogli ancora), per risospenderle, si prende l'aliquota e si mette nella nuova piastra, e si arriva a volume con terreno più siero. |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2008 : 21:22:36
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| Quindi per rispondere utilizzo il terreno ( DMEM ) e poi porto a volume con il siero. Oppure l'uno e l'altro devono stare in una certa percentuale? Ti ricordi quanto volume ci sta nei tre tipi di piastre? Grazie mille. |
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
6941 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2008 : 21:40:30
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| No no no! La percentuale di siero, in genere è del 10% del totale del volume, poi dipende: dopo infezione con influenza ad esempio ci va il 2%, dopo rotavirus non ci va affatto, ma per una coltura di una linea cellualre in genere è del 10%: 0.5 ml di cellule, 4 ml tereno e 0.5 siero, per un totale di 5 ml, ad esempio. Quanto volume? In quella da 3,5 mi pare un paio di ml, nelle altre no, mi dispiace |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 22 maggio 2008 : 16:36:29
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| Grazie..dal tuo no ho capito che se porto a volume con il siero la prof mi butta fuori dal lab. I volumi cercherò di recuperarmeli dai miei vecchi appunti. Del volume totale iòl 10% è siero e un apiccola parte la mia sospensione cellulare. |
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2008 : 00:09:08
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Premesso che non ho mai infettato con virus, mi sento
in dovere di aggiungere un paio di consigli:
> Non portare mai a volume col solo DMEM aggiungendo
ogni volta il siero: troppe operazioni aumentano il
rischio di imprecisione/contaminazione/rimbambimento.
Prepara apposite bottiglie di DMEM in cui hai aggiunto
il siero alla percentuale che ti serve (che a quanto
ho capito è diversa da virus a virus, ma di norma non
dovrebbe mai superare il 10%).
> Nelle piastre da 3,5 cm/diametro ci vanno circa 2 ml
Nelle piastre da 6 cm/diametro ci vanno circa 4 ml
Nelle piastre da 10 cm/diametro ci vanno circa 8 ml
In realtà questi volumi possono anche essere
"economizzati" oppure abbondati, a seconda di
particolari esigenze (ad es. devi lasciare le
cellule in incubatore per poche ore, piuttosto
che per diversi giorni)
> Se il mio capo ti vedesse portare a volume col siero,
impareresti diversi nuovi tipi di bestemmie locali.
> (per Giuliano) pure tu con le MDCK?
altro che caffè! puoi anche farti uno spuntino!
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Giuliano652
Moderatore
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2008 : 11:26:44
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| Ma per caso mi mandareste il protocollo di qualke esperimento che avete fatto in laboratorio..magari non ci capirò molto ma spero che sareste disponibili per chiarimenti.Grazie. |
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Giuliano652
Moderatore
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Didattica e Relazioni
