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Giuditta
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6 Messaggi

Inserito il - 07 agosto 2013 : 12:39:56

Eccomi di nuovo a chiedervi un aiuto

Sto cercando di produrre del lentivirus. Il vettore che sto usando è un derivato di questo (http://www.addgene.org/12254/), hanno sostituito la porzione della GFP con una resistenza alla blasticidina.
Nel sito dicono "A popular cloning strategy is to clone into the PmeI site upstream of the EMCV IRES. You can also clone into the PacI or SwaI site.". PmeI e SwaI non potevo usarli, ho optato quindi per PacI usandolo per linearizzare il vettore e inserirvi il mio gene. Il clonaggio è stato un parto ma alla fine è andato. Purtroppo il lentivirus prodotto non esprime la mia proteina, mentre un controllo fatto in parallelo con un vettore che ho ricevuto già pronto ha un'efficienza ottima, facendomi escludere errori nella preparazione.

Il dubbio che mi attanaglia ora è...ho sbagliato a clonare il mio gene a monte del sito cPPT? Nel sito Addgene non ho trovato alcuna indicazione su una necessità di clonare a valle del tratto, anzi, il trafiletto che vi ho copiato mi ha lasciato intendere essere indifferente.
In letteratura ho invece trovato clonaggi solo a valle e anche articoli su una presunta efficacia del cPPT solo sulla porzione a valle, non su quella a monte. QUalcuno di voi ha esperienza in merito e saprebbe chiarirmi le idee?