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marcocatucci
Nuovo Arrivato


Prov.: Estero
Città: Leeds, England


19 Messaggi

Inserito il - 26 gennaio 2006 : 17:02:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marcocatucci  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di marcocatucci Invia a marcocatucci un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve,
sul gel dove separo i prodotti di RT-PCR,
mi compare un grossa banda a 100bp
che corrisponde ai dimeri di primer che si formano
durante la PCR stessa.
Questa banda infatti compare anche se faccio
una PCR solo con primer, senza cDNA.
Mi dicono che e' normale vederla,
pero' quella che io ottengo e' troppo evidente,
tanto da coprire la banda del gene di interesse.
Ho provato ad usare come temperature di annealing 59 e 60 gradi,
ma senza buoni risultati.
Ho provato anche a cambiare primer, ma niente.
Sapreste aiutarmi? Ve ne sarei grato.

Marco

W la Ricerca

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 26 gennaio 2006 : 21:02:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh, proprio proprio normale non e'... non dovresti avere primer dimers.

Io fossi in te ridisegnerei meglio i primer.
C'e' un simpatico programma x Mac chiamato Amplify che ti puo far vedere eventuali primer dimers.
Se hai problemi facci sapere che gene stai cercando di amplificare e vedremo di aiutarti!

Ciao!!!

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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 27 gennaio 2006 : 14:30:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In effetti l'unico modo per quella che è la mia esterienza da tecnico, per eliminare i dimeri di primer è di disegnarli meglio, ma cosa significa chick fare ciò? Solitamente non danno problemi e li si lasciano così ,se fai solo semiquantitative. Comunque, se fai una PCR senza il cDNA è normale che si vedano solo i dimeri di primers.
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 27 gennaio 2006 : 21:36:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh, significa osservare qualche piccola regola tipo:

1) T melting x i singoli primer molto simile (non piu differente di 0.5-1 gradi) e attorno ai 55-57
2) Contenuto in GC tra 40 e 60%
3) Evitare sequenze palindrome
4) Evitare sequenze ripetute

Ci possono essere poi altre piccole sottigliezze a seconda della Taq che usi

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Tat
Nuovo Arrivato


Città: Milano


33 Messaggi

Inserito il - 31 gennaio 2006 : 22:13:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tat Invia a Tat un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non è che sbagli la concentrazione dei primers??? é troppo alta e quindi si formano più dimeri di primers che di prodotto?...Sicuramente non sarà così...quindi anche secondo me dovresti ridisegnare meglio i primers, oppure puoi provare ad aumentare ancora di più la T di annealing...io sono arrivata a 66 °C se i primers sono specifici si annilano!!!
Ciao e good luck
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