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marcocatucci
Nuovo Arrivato
Prov.: Estero
Città: Leeds, England
19 Messaggi |
 Inserito il - 26 gennaio 2006 : 17:02:02
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Salve,
sul gel dove separo i prodotti di RT-PCR,
mi compare un grossa banda a 100bp
che corrisponde ai dimeri di primer che si formano
durante la PCR stessa.
Questa banda infatti compare anche se faccio
una PCR solo con primer, senza cDNA.
Mi dicono che e' normale vederla,
pero' quella che io ottengo e' troppo evidente,
tanto da coprire la banda del gene di interesse.
Ho provato ad usare come temperature di annealing 59 e 60 gradi,
ma senza buoni risultati.
Ho provato anche a cambiare primer, ma niente.
Sapreste aiutarmi? Ve ne sarei grato.
Marco
W la Ricerca
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 26 gennaio 2006 : 21:02:39
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Beh, proprio proprio normale non e'... non dovresti avere primer dimers.
Io fossi in te ridisegnerei meglio i primer.
C'e' un simpatico programma x Mac chiamato Amplify che ti puo far vedere eventuali primer dimers.
Se hai problemi facci sapere che gene stai cercando di amplificare e vedremo di aiutarti!
Ciao!!!
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2006 : 14:30:30
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| In effetti l'unico modo per quella che è la mia esterienza da tecnico, per eliminare i dimeri di primer è di disegnarli meglio, ma cosa significa chick fare ciò? Solitamente non danno problemi e li si lasciano così ,se fai solo semiquantitative. Comunque, se fai una PCR senza il cDNA è normale che si vedano solo i dimeri di primers. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2006 : 21:36:48
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Beh, significa osservare qualche piccola regola tipo:
1) T melting x i singoli primer molto simile (non piu differente di 0.5-1 gradi) e attorno ai 55-57
2) Contenuto in GC tra 40 e 60%
3) Evitare sequenze palindrome
4) Evitare sequenze ripetute
Ci possono essere poi altre piccole sottigliezze a seconda della Taq che usi |
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Tat
Nuovo Arrivato
Città: Milano
33 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2006 : 22:13:20
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Non è che sbagli la concentrazione dei primers??? é troppo alta e quindi si formano più dimeri di primers che di prodotto?...Sicuramente non sarà così...quindi anche secondo me dovresti ridisegnare meglio i primers, oppure puoi provare ad aumentare ancora di più la T di annealing...io sono arrivata a 66 °C se i primers sono specifici si annilano!!!
 Ciao e good luck |
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Dimeri di primer
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