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marcocatucci
Nuovo Arrivato
Prov.: Estero
Città: Leeds, England
19 Messaggi |
 Inserito il - 31 gennaio 2006 : 13:47:48
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Salve!
Ho analizzato alcuni campioni di cDNA
con Real Time PCR (TaqMan Assay per la precisione).
Il protocollo suggerisce di utilizzare
dai 10 ai 100 ng di cDNA per ciascun pozzetto.
Per essere sicuro di utilizzare la giusta quantita' di cDNA,
ho misurato ogni campione allo spettrofotometro.
Nonostante cio', alcuni campioni mi hanno dato valori di Ct
piu' alti di 34.
Non sono un esperto, ma questo dovrebbe significare
che in quei campioni c'era poco cDNA, vero?
E' probabile che il mio spettrofotometro non funzioni.
Mi pongo, e vi pongo, questa domanda.
Non potrebbe succedere che mettendo troppo cDNA
la reazione venga inibita e quindi si ottengano Ct alti?
Se non e' cosi' allora che valore Ct si ottiene
quando c'e' troppo cDNA nel pozzetto?
Grandi esperti di Real Time, aiutatemi!
Grazie
Marco
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2006 : 14:08:03
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Beh, un Ct di 34 e' abbastanza alto, io vedevo quei valori cercando fattori di crescita che sono espressi a livelli molto bassi.
Non e' possibile che semplicemente il tuo gene sia poco espresso in quei campioni?
Con lo spettrofotometro d'altronde vedi tutto il DNA non solo il gene di interesse. |
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Tat
Nuovo Arrivato
Città: Milano
33 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2006 : 22:08:32
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Teoricamente se i ct sono così alti significa che l'espressione è bassa...anche io li avevo quei valori in alcuni esperimenti. Poise vuoi fare una prova sui valori dei ct potresti usare dei geni house-keeping: actina, GAPDH, gene che codifica per l'rRNA..ti fai una specie di curva standard utilizzando valori crescenti di cDNA così vedi il numero di cicli al quale ti esce il campione e così puoi fare un confronto con il tuo campione.
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marcocatucci
Nuovo Arrivato
Prov.: Estero
Città: Leeds, England
19 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2006 : 14:53:47
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Scusa tat, non mi sono spiegato bene.
Anche il controllo endogeno mi ha dato Ct>34.
Ho usato il gene ABL.
Cosa significa fare una curva standard?
Devo fare una pcr saggiando solo ABL,
per capire a quale diluizione devo utilizzare il cDNA?
Grazie
Marco
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Dannata Real Time PCR!!
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