| Autore |
Discussione |
|
|
chiaaderosa
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
 Inserito il - 26 novembre 2008 : 21:29:02
|
ciao a tutti, qualcuno è esperto di co-immunoprecipitazione di proteine? se potete aiutarmi ve ne sarei molto grata....devo scrivere a breve la tesi ma sono bloccata su un esperimento importante.....grazie e baci...........
|
|
|
|
|
domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
|
|
chiaaderosa
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 20:00:44
|
allora.....in poche parole....(sperando di riuscirci)....io ho immunoprecipitato un proteina (per semplificare il tutto la indico con A)A per la quale è stato ipotizzato un legame con una seconda proteina, B.
Ho fatto un western blotting e rivelato con un anticorpo anti-B e mi è apparsa la bandina in corrispondenza del peso molecolare della proteina B...e qui mi sono entusiasmata....perchè significava che l'esperimento era riuscito....!!!
ma poi ho osservato il controllo negativo....cioè un immunoprecipitato fatto con un IgG di rabbit qualsiasi (in quanto la proteina A è fatta in rabbit) e sfortunatamente quella bandina era anche lì presente....
questo significa che il mio anticorpo anti A è uno specifico?
e come procedere in questi casi?
grazie mille a tutti................. |
 |
|
|
domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 20:48:55
|
Per capire:
Come hai immunoprecipitato la proteina A? con un Ab anti-A? con un Ab anti-tag? A e B sono trasfettate? Sono endogene?
Se ho capito bene hai immunoprecipitato la tua proteina con un anti-A, nel controllo negativo hai messo un altro anticorpo?! Poi hai fatto un WB anti-B e vedi una banda sia nel controllo che nel tuo campione?! sono della stessa intensità?
Per quello che ho capito sembrerebbe proprio un aspecifico. Ma è strano un Anticorpo anti-B che ha un aspecifico proprio sul peso della proteina B...
L'anticorpo l'hai comprato? C'è traccia di questo aspecifico sul datasheet? Hai provato l'anticorpo sui totali (no immunoprecipitati)
Scusa per le tante domande... |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
|
|
|
chiaaderosa
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 21:46:55
|
allora domi84...vedo che ne capisci...allora ti spiego tutto nei minim particolari.....
la proteina A è stata immunoprecipitata con una anticorpo anti-A...ed è una proteina presente normalmente nelle cellule....quindi endogena...
Il partner di A, cioè B (iperespressa mediante trasfezione, viene rivelato mediante western-blotting con un anti-tag (myc)....
come ti dicevo prima la banda in corrispondenza di 100 (che è ilo peso molecolare di B) :
- mi compare nell'immunoprecipitato in cui ho utilizzato il lisato trasfettato
- mi compare nel lisato trasfettato
- non mi compare nell'immunoprecipitato in cui ho utilizzato il lisato di cellule non trasfettate
tutte cose positive....se non fosse per quella bandina che mi compare nell'immunoprecipitato che dovrebbe essere il mio controllo negativo.....cioè quello ottenuto (sempre utilizzando il lisato trasfettato) immunoprecipitando con un IgG di rabbit qualunque....tuttavia, come mi hai chiesto...questa banda non è della stessa intensità rispetto a quella di prima..
L'anticorpo anti-A l'abbiamo comprato da poco, ma quelle IgG di rabbit no...quindi non saprei....... |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2008 : 23:55:15
|
Beh essendo iperespressa magari non riesci ad eliminarla tutta nel controllo negativo e qualcosa si lega aspecificamente alle IgG o alle beads.
Hai provato a fare un controllo negativo anche senza anticorpo e senza IgG? Solo con le beads? |
|
|
|
domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2008 : 21:10:56
|
Non credo sia un aspecifico. Altrimenti avresti dovuto vederlo anche nell'IP non trasfettato. Invece quello è vuoto.
Io rifarei l'esperimento cambiando quel controllo negativo, invece di usare quella IgG di Rabbit usa qualcos'altro...Un anti-flag per esempio. Può essere che questo tuo anticorpo del controllo negativo si leghi aspecificamente a qualcosa, che a sua volta tira giù B trasfettato.
Può anche essere come dice GFPina che B trasfettato è troppo, per cui non riesci a lavarlo bene, per questo potresti fare un controllo con solo beads, e vedere se comunque rimane del B.
Inoltre (se vedi bene la banda) potresti trasfettarne giusto un pochino in meno, e fare qualche lavaggio degli immunoprecipitati in più.
P.S. Siccome ci sono molti che se ne intendono di immunoprecipitati, ed in generale di Tecniche di Biologia Molecolare su questo forum (siamo qui apposta, no?! ) la prossima volta dicci tutti i dettagli dall'inizio...potremo aiutarti prima.
CIAO!! |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
|
|
|
chiaaderosa
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2008 : 13:55:48
|
| ok....grazie mille a tutti......davvero....proverò varie alternative....baci |
|
|
| |
Discussione |
|
co-immunoprecipitazione
Didattica e Relazioni
