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Isidora
Nuovo Arrivato
Città: milano
48 Messaggi |
 Inserito il - 31 gennaio 2009 : 10:49:32
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ciao a tutti fra breve avrò un'esame e sono un po' confusa su certe tecniche sperimentali
qualcuno saprebbe brevemente spiegarmi a cosa serve la tecninca cell-free e possibilmente come viene allestita..non mi è molto chiaro
in più ho delle difficoltà su una domanda
come verifichereste sperimentalemente che la trasduzione del segnale è un fenomeno transiente??
grazie mille spero che mi rispondiate presto così mi chiarisco
mi va bene anche se mi scrivete link da cui posso atingere o libri
ciao
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La perplessità è l'inizio della conoscenza. Kahlil Gibran |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2009 : 11:16:39
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Citazione:
qualcuno saprebbe brevemente spiegarmi a cosa serve la tecninca cell-free e possibilmente come viene allestita..non mi è molto chiaro
Hmmmm... al momento mi sfugge, devo controllare
Citazione:
come verifichereste sperimentalemente che la trasduzione del segnale è un fenomeno transiente??
Beh, ovviamente dipende dal tipo di cascata.
Ad es. se consideri una cascata che coinvolge delle chinasi avrai, ad es:
fattore X -> binding al recettore -> attivazione chinasi 1 -> attivazione chinasi 2 -> effetto "finale"
Prendi diverse piastre di cellule, le tratti al tempo 0 con il fattore X e poi le raccogli a vari tempi (es. 3 piastre a tempo 0, 3 a 5 minuti, 3 a 10 minuti, etc.)
Estrai le proteine e fai un western blot per rilevare chinasi 1 e chinasi 2 normali e fosforilate.
Potresti ad es vedere un risultato (ipotetico) del genere:
Tempo Chinasi 1P Chinasi 2P
0 - -
10 +? -
15 + -
20 ++ +
25 + ++
30 - +
35 - -
Dove i valori sono normalizzati all'intensità della banda della rispettiva chinasi non fosforilata.
Se invece il tuo segnale è accoppiato a PLC, puoi ad es. monitorare il rilascio di Ca2+ dai recettori IP3 usando tecniche di calcium imaging.
Il limite è la fantasia... :p |
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Isidora
Nuovo Arrivato
Città: milano
48 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2009 : 11:43:16
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geniale...hai ragione ...che scema non ci avevo pensato
grazie mille ora mi sn sbloccata
se riesci a trovare informazioni su cell-free fammi sapere
grazie ancora |
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Isidora
Nuovo Arrivato
Città: milano
48 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2009 : 11:50:44
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ascolta posso chiederti un'altra verifica?
per verificare sperimentalemnte se sono presenti sulla membrana di una cellula dei recettori capaci di interagire con un ligando specifico posso usare la tecnica della marcatura radioattiva del ligando ?! e attuo l'analisi quantitativa del ligando marcato radioattivamente che lega il recettore nella mia preparazione?! ora ti ho detto le cose in modo sintetico ma come procedura ci può stare?
in seguito isolo purifico
per caso mi sapresti dire altre tecniche interessanti per indagini sull'identificazione recettori?
grazie ciao ciao
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2009 : 13:13:39
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Citazione:
per verificare sperimentalemnte se sono presenti sulla membrana di una cellula dei recettori capaci di interagire con un ligando specifico posso usare la tecnica della marcatura radioattiva del ligando ?! e attuo l'analisi quantitativa del ligando marcato radioattivamente che lega il recettore nella mia preparazione?! ora ti ho detto le cose in modo sintetico ma come procedura ci può stare?
in seguito isolo purifico
Questo è uno dei metodi classici. Lo svantaggio di questo metodo, ovviamente, è di dover utilizzare il radioattivo.
Se il tuo recettore è noto ci sono anche metodi più semplici come l'immunoistochimica oppure l'utilizzo di ligandi selettivi per quel particolare recettore (se vedi un effetto del ligando selettivo allora il recettore sarà presente).
Ovviamente tutto dipende dalla situazione specifica che stai analizzando.
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Isidora
Nuovo Arrivato
Città: milano
48 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2009 : 13:55:27
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si infatti ho letto il fatto degli svantaggi...
vado subito ad informarmi riguardo l'immunoistochimica
grazie ancora ...se ho altri dubbi sperimentali li scrivo
grazie ciao  |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 11:35:47
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Riguardo al "cell-free" non è una tecnica, ma meglio un "sistema" per studiare determinati processi. "cell-free" significa che non utilizzi cellule, in pratica alcuni componenti cellulari vengono separati mediante ultracentrifugazione e poi vengono utilizzati per uno studio in vitro di meccanismi cellulari. Ad es. replicazione del DNA, trascrizione o sintesi di proteine in vitro.
In questo link è spiegato un po' come funziona:
Cell-Free Systems
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Isidora
Nuovo Arrivato
Città: milano
48 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 17:16:56
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fantastico grazie mille
ciao ciao |
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cell-free system
Didattica e Relazioni
