Si per il CTD dovevi andare a fare immunoprecipitati oppure in vitro andavi a regolare la fosforilazione della coda per vedere se il capping si legava o meno.
Mi raccomando domani Paolo, vedi quello che devi scrivere, lo sai che Presutti se trova due risposte uguali, soprattutto su questi argomenti fantasioni cestina i compiti vero?...
L'isolamento, non avendo la vostra esperienza ovviamente è una questione solo di logica, non so se realmente si può fare.
Ok diciamo che non si può fare!
Citazione:Messaggio inserito da ilchimicomat
Ho usato il termine "iniettato dentro" per differenziare le cellule mutanti da quelle normali (è ovvio che hanno il miRNA nel loro genoma, almeno quello)
Si ma se usi il termine "iniettato dentro" all'esame non penso il tuo Prof. la prenda molto bene! Si dice endogeno!
Citazione:Messaggio inserito da ilchimicomat
Per mutagenizzare le 3'-UTR non posso operare direttamente sulle basi nucleotidiche del genoma e quindi ho pensato ci faccio inserire tramite trasposizione omologa un breve tratto di sequenza estranea che mi rompe la cornice di lettura corretta relativa alla 3', in modo tale che così viene alterata...
casomai ricombinazione omologa! Comunque non è una cosa così semplice in pratica! La ricombinazione omologa non avviene "così" in tutte le colture cellulari. Ma il discorso qua sarebbe un po' lungo.
Citazione:Messaggio inserito da Garzgul
-In una linea cellulare faccio overesprimere, transfettando con un vettore, un miRNA specifico per un mRNA con prodotto proteico noto in modo da inibire o limitare la sua produzione mentre lascio intatta l'altra linea, usandola come controllo. -Faccio il Western blot per verificare i diversi livelli di produzione proteica, dovrei vedere che nella linea cellulare transfettata c'è assenza o quantità limitata della proteina rispetto alla linea cellulare di controllo.
Quindi in realtà è molto semplice vista così no?
Si detta così è molto semplice, ma a parte le questioni pratiche (ovviamente la pratica non è così semplice come la teoria). Facendo così secondo me non dimostri che c'è direttamente interazione. A mio avviso gli esperimenti sarebbero da fare entrambi, sia quelli "in provetta" che quelli su colture cellulari.
Non voglio dire che sia sbagliato, ma per farvi pensare un po' al vostro futuro visto che avete scelto questa strada. Se date una risposta così per l'esame può andare bene (dipende dal vostro prof questo), è comunque un esperimento che tende a verificare l'ipotesi "interazione miRNA-mRNA" e il Prof può dire "ok un idea l'ha avuta!". Se invece foste in un laboratorio e mandaste un articolo con solo questo esperimento il reviewer ve lo rimanderebbe subito indietro dicendo di fare altri esperimenti per verificare l'ipotesi.
Questo per spiegare il mio punto di vista immagino che in questo momento la cosa che vi interessa di più sia passare l'esame comunque!
Citazione:Messaggio inserito da Garzgul
Anche perchè credo che le regione 3'-UTR siano più complicate da modificare e forse meno attendibili per certi aspetti (almeno secondo la mia impressione). Crreggetemi se ho detto una castroneria!
Beh come dicevo quella è una cosa che si fa molto più facilmente in vitro, inteso come "in provetta". Vedi EMSA.
Citazione:Messaggio inserito da Garzgul
PS2:per il lievito S.pombe ci sono studi, tanto che la V edizione italiana del Watson ne parla, ma riguardano il silenziamento genico mediato dalle modificazioni della cromatina nelle regioni centromeriche e riguardano i siRNA (short interfering RNA).
Si era quello che diceva anche Dionysos, ma sono una cosa un po' diversa.
Per l'altra domanda, per quanto mi riguarda... un altra volta!!!
Mi raccomando domani Paolo, vedi quello che devi scrivere, lo sai che Presutti se trova due risposte uguali, soprattutto su questi argomenti fantasioni cestina i compiti vero?...
Grazie GFPina sei stata utilissima. Purtroppo la domanda è una e vale ben 12 punti...
P.S. Ho riletto quello che avevo scritto, sarà la tensione per l'esame, ma certo scrivere trasposizione omologa invece che ricombinazione..che errore, vabbe perdonami.
Si tranquillo Matteo, non c'è problema, solo che fino a 1 minuto prima di vedere questo thread ero impanicato dalla domanda sperimentale che ci potranno sottoporre domani (anche se comunque l'unica risposta sensata e non troppo stravagante è quella a cui siamo giunti, quindi basta non mettere le stesse identiche parole, ma alla fin fine i concetti sono quelli)! Comunque è sottointenso che stiamo parlando in linea MOLTO MOLTO teorica, dato che questo professore vuole che ci ingegniamo, però noi studenti non abbiamo ancora esperienza pratica o conoscenze tali da formulare pensieri sperimentali seri, infatti molti studenti del nostro corso danno l'esame del modulo di RNA il semstre successivo, dopo aver seguito altri corsi finalizzati al laboratorio e alla pratica in generale! Però così noi abbiamo risolto! Grazie a tutti!
Mi inserisco in questa discussione visto il seguito...Volevo chiedere su quali testi potevo approfondire l'argomento degli miRNA e dell' RNAi...Dyonisos, dove le hai trovate tutte quelle informazioni?
Citazione:Volevo chiedere su quali testi potevo approfondire l'argomento degli miRNA e dell' RNAi...Dyonisos, dove le hai trovate tutte quelle informazioni?
Ciao Matteo, non conosco nessun testo che tratti specificamente l'argomento (a parte il Lodish 5th edition in e lo Strachan ultima edizione, ma ci sono solo i concetti basilari). Le info le ho acquisite...facendoci la tesi :P (triennale ovviamente). Se ti interessa te la posso passare via msn o upload, così scegli tu dalla bibliografia i riferimenti che t'interessano, perchè sono davvero tanti!
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà (F.W. Nietzsche)
Magari Dyonisos, non sarebbe male...Appena ho tempo tra una lezione e l'altra mi collego a MSN e ti faccio sapere...Grazie mille...Grazie anche a te Zerhos...E' un mondo che mi affascina veramente tanto...
Concordo queste cose le apprendi dalla leteratura, la prima cosa che ti consiglio di fare e andare in Pubmed e cercare le review al riguardo, ce ne sono ormai moltissime. Io ne ho un po', ma sicuramente da Pubmed hai molta più scelta e vedi cosa ti interessa di più, poi se hai problemi ad accedere chiedi!
Inoltre ci sono anche parecchie discussioni sul forum sui miRNA in cui sono inseriti vari link!
DOmanda!!! rispondetemi in fretta vi prego.... se in un esperimento io noto che non ci sono variazioni del livello di mRNA target potrebbe essere dovuto cmq ad azione di miRNA! se si perchè? io sapevo che in ogni caso gli mRNA venivano sequestrati pertanto se analizzo il livello di mRNA dovrei avere un abbassamento dei livelli e poi ovviamente il corrispettivo abbassamento della proteina... oppure può esserci abbassamento dei livelli di proteina senza abbassamento di livelli di mRNA??? vi prego spiegatemi perchè su un articolo ho trovato che siccome non ci sono cambiamenti nel livello di mRNA ma si a livello di proteina ipotizzano regolazione post trascrizionale di miRNA e fanno gli studi sui miRNA ma per me questa cosa nn ha molto senso...io sapevo che ci doveva essere un abbassamento anche dell'mRNA.... GRAZIE
Interazione gene-miRNA
Didattica e Relazioni
Inserito il - 04 marzo 2009 : 20:17:34
