| Autore |
Discussione |
|
|
Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
 Inserito il - 12 marzo 2009 : 09:46:17
|
|
Ma si può sbagliare ad ordinare dei primers per tre volte...e adesso io devo ricominciare questro maledetto clonaggio per la seconda volta dopo che avevo gia ottenuto il mio bel plasmide. Ma perchè i capi non stanno attenti per quelle poche cose che devono fare? Sette mesi di lavoro buttato. si, ho imparato ma mi rode che per errori di altri forse non farò in tempo a laurearmi ad ottobre. Non è giusto. Voglio andarmene all'estero a fare ricerca appana laureata..dopo quest'esperienza di tesi in quello che dovrebbe essere un laboratorio di ricerca serio in uno deglio ospedali migliori di roma non ho più dubbi. Purtroppo quando i capi se ne fregano la ricerca non va avanti. C'è poco da fare...scusate la sfogo.
|
|
|
|
|
Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 12 marzo 2009 : 14:30:14
|
quoto lo sfogo.
accade questo e accade anche di peggio.
purtroppo il merito non conta nulla,
non qui
non di questi tempi
si agisce perfettamente e poi
si pagano gli errori degli altri
(avrei anch'io la mia recente
storia da raccontare, ma lascio correre) |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
|
 |
|
|
mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 12 marzo 2009 : 14:37:50
|
Cara Flap, purtroppo le "testine"  ci sono ovunque, anche all'estero.
Non ho ben capito se l'errore è stato del capo, di qualcuno che è sopra di te ma sotto il capo, o cosa?!
Ad ogni modo...
...amo questo lavoro con tutta me stessa e non mi arrenderò mai!
Tieni duro Flap!!
|
|
|
|
Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 12 marzo 2009 : 20:21:32
|
| L'errore è stato di chi dirige il mio lavoro, della mia tutor. Se fosse la prima volta ok...capisco che in questo lavoro si fanno tanti errori e per una cosa che impari ne sbagli 100. Però penso che se devi ordinare dei primers per iniziare un clonaggio devi stare attenta che in quei primers ci siano i siti per l'enzima di restrizione che mette la proteina in frame. sicuramente non è un lavoro facile , io non l'ho mai fatto ed immagino che sia complicato però penso che dopo aver sbagliato per una volta dovresti fare molta attenzione la seconda volta a non sbagliare di nuovo soprattutto se fai questo lavoro da una vita. é vero che si procede per tentativi però qui sono mesi di lavoro buttati al vento. La prima volta i primers eliminavano l'hist tag, stavolta mettono la proteina fuori frame. Cosa che si sarebbe tranquillamente visto se una volta prodotto il plasmide qualcuno si fosse preoccupato di sequenziarlo. Invece siamo andati avanti con i tentativi per esprimerla...chiaramente tutti falliti. |
|
|
|
legolas
Utente
Prov.: Lecce
Città: Trepuzzi
723 Messaggi |
Inserito il - 13 marzo 2009 : 08:13:48
|
| Queste cose le abbiamo passate tutti.Quanto ti capisco! |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 13 marzo 2009 : 08:27:47
|
| Ti assicuro che di gente così ne trovi in ogni parte del mondo, non è un fenomeno solo italiano una volta tanto. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 13 marzo 2009 : 10:00:29
|
Citazione:
Messaggio inserito da Flap
L'errore è stato di chi dirige il mio lavoro, della mia tutor. Se fosse la prima volta ok...capisco che in questo lavoro si fanno tanti errori e per una cosa che impari ne sbagli 100. Però penso che se devi ordinare dei primers per iniziare un clonaggio devi stare attenta che in quei primers ci siano i siti per l'enzima di restrizione che mette la proteina in frame.
Perché non provate con una e-pcr prima di ordinare i primers?
Ovvero, con una simulazione al computer di quello che viene amplificato. |
Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
|
|
|
mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 13 marzo 2009 : 17:08:29
|
Cavolo...devo proprio impare a utilizzare qualche tool in rete!
Per il disegno dei primers...non è difficile capere il meccanismo, ma ci vogliono moooolta pazienza e precisione. Quando devo disegnarne una nuova coppia, preventivo di perdere almeno 2-3 ore. 
Secondo me il problema è che questa persona non rispetta il tuo lavoro e neanche il suo!!!
Bisogna metterci tutta l'anima per far bene le cose....anche per attaccare un bottone!!!
Cmq, se vuoi sapere come si fa posso darti qualche consiglio, Così la prox volta li controlli tu!!!
Ciao!!!!
|
|
|
|
Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 16 marzo 2009 : 14:53:27
|
| Scusa..è da un pò che non guardavo se c'erano altre risposte al mio post. L'e-pcr non so che sia e dubito che nessuno qua dentro lo sappia. Riguardo ai consigli per disegnare i primers invece te ne sarei grata. Dubito che la mia tutor abbia perso due , tre ore di tempo come fai tu per farlo. Più che altro dovresti dirmi da dove cominci perchè ho seguito questo progetto dall'inizio alla fine eccetto che per il disegno dei primers. Credo che sia veramente il mio unico neo. |
|
|
|
fpotpot
Utente
Città: middleofnowhere
1056 Messaggi |
Inserito il - 16 marzo 2009 : 15:01:58
|
concordo come nn sia un fenomeno italiano.
Al max planck di potsdam (germania) dove ho lavorato un anno,il mio capo di lì,pieno di pubblicazioni e molto bravo nel suo campo (ancorchè assolutamente pazzo dal punto di vista umano) nn ha spedito i miei risultati di riannotazione di una sequenza espressa di un gene.
Risultato:niente pubblicazione e l'ho saputo tramite una terza persona (un professore negli USA).
Quindi i capi stronzi e inutili ci sono ovunque,ahimè. |
|
|
|
mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2009 : 12:21:05
|
Tanto per cominciare ecco dei link che ti serviranno:
http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html
http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_olignucleotides.asp
La prima cosa da fare è verificare le caratteristiche del tuo vettore, controllando quali enzimi taglino nel MCS e se ci sono ATG e cod stop. Ne scegli due che siano compatibili tra di loro (se vuoi utilizzarli insieme. Basta guardare nel catalogo). A questo punto verifichi che gli enzimi scelti non taglino all'interno della sequenza del tuo inserto. Per fare ciò utilizza il link WEBCUTTER: inserisci la tua seq. in FASTA e poi gli dai "all enzymes in the database".
Se tutto va bene utilizzi l'altro link "cleavage..." per verificare l'efficienza di taglio degli enzimi e per capire quanti nt aggiungere.
Controlla sulla mappa del tuo vettore la posizione del taglio dei tuoi enzimi; l'enzima che viene prima nella lista va inserito sul primer Fw...il secondo sul Rev (pr.Fw: enz + seq / pr. rev: enz + seq revertata. Il numero di nt della seq dipende da quale tm hai bisogno).
A questo punto devi verificare che i due primer aggiunti alla tua seq. non cambino la seq. amminoacidica. Questa cosa la fai con ORF FINDER: inserisci ATG + Pr Fw e poi la tua cds. Se hai il tuo stop già inserito, non c'è bisogno che inserisca anche il rev.
A questo punto, se tutto è andato bene hai i tuoi primers.
Ci fai un Blast sopra e...INCROCIA le dita!!!
Scusa se è scritto un po' male, ma di tanto in tanto mi sono allontanata per terminare i miei esperimenti.
|
|
|
|
Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2009 : 13:42:46
|
| Grazie...cercherò di decifrare a poco a poco tutto questo. Mi pare un gran casino e ci metterò tempo. Sicuramente ti chiederò qualche delucidazione più avanti. |
|
|
|
Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2009 : 14:33:57
|
Ma cosa intendi precisamente quando dici che devo aggiugere dei nucleotidi? Intendi la lunghezza dei primers o qualcos'altro?
Partiamo dall'inizio..perchè non capisco nulla. Io ho il mio gene L1 di cui ho scaricato la sequenza a partire dall'ATG e a finire con TAA. All'inizio era clonato in un plasmide batterico e da lì ho amplificato usando i primers che mi sarebbero poi serviti per clonarlo in Pyes. La parte del primer che contiene il sito per l'enzima è quella che si trova sul vettore mentre ho bisogno che dall'ATG la sequenza sia l'esatta copia dell'originale,no? Quello che inizia dall'ATG è il FR,vero? Scusa per le domande stupide.. |
|
|
|
mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2009 : 16:33:02
|
"Se tutto va bene utilizzi l'altro link "cleavage..." per verificare l'efficienza di taglio degli enzimi e per capire quanti nt aggiungere"
intendo dire che nel link che ti ho suggerito ti dà diverse possibilità:
XbaI: C TCTAGA G 8 0
GC TCTAGA GC 10 >90
TGC TCTAGA GCA 12 75
CTAG TCTAGA CTAG 14 75
In questo esempio la prima colonna di numeri ti dice la lunghezza della catena, la seconda l'efficienza di taglio a 2 ore. Chiaramente se dovessi scegliere questo enzima sceglierei di aggiungere al sito di taglio GC all'inizio e GC alla fine (cioè la seconda riga). A questo punto dovresti andare su ORF finder e verificare che non cambino gli amminoacidi. Ricorda di scaricare la tua sequenza in fasta e soprattutto solo la CDS!
Dimenticavo...non esistono domande stupide!
L'ATG iniziale codifica per la Metionina, ma è anche è il codone d'inizio della regione codificante!
|
|
|
|
mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2009 : 16:34:55
|
| Scusa...forse è meglio se vai sul collegamento per vedere le colonne! |
|
|
|
Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2009 : 21:30:49
|
| Ok..le tabelle le ho viste e più o meno capite. Ma ho qualke altra domanda..dove devono appaiarsi i primers? Per non cambiare la sequenza amminoacidica della proteina da amplificare essi dovrebbero appaiarsi prima dell'ATG di inizio o comunque possono contenere il TAC alla fine , al 3'. Quello che voglio kiederti è se il sito di taglio per l'enzima di restrizione si trova al 5' del primer subito prima del TAC ( ATC nello stampo ). Quando io taglio con il mio enzima vettore e inserto devo fare in modo che tutto sia in frame per ottenere la proteina di fusione. Adesso mi sorge un altro dubbio..a livello del MCS del mio plasmide c'è un ATG, 6 HIS e qualcos'altro..tutto codifica. La fase di lettura che non deve essere interrotta è quella del vettore a partire da questo ATG e poi quella dell'inserto con il suo ATG ? Non so se mi sono spiegata..il fatto è che il vettore ha un inizio e una fine di traduzione a livello del MCS e all'interno deve essere clonata una proteine con un suo inizio e una sua fine. Mi sfugge qualcosa..qual'è l'ORF da considerare? |
|
|
|
moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2009 : 15:13:09
|
Citazione:
Messaggio inserito da legolas
Queste cose le abbiamo passate tutti.Quanto ti capisco!
Bhè no,
se nemmeno si pensa a sequenziare un plasmide prima di investire soldi e tanto tempo prezioso nell'espreimere una proteina...non ha proprio senso far ricerca, passi lo sbaglio dei primer che può succedere a tutti ma almeno se si possono fare dei controlli fra un passaggio e un altro ... |
|
|
|
mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2009 : 14:32:17
|
Ciao Flap...non mi sono dimenticata di te!
Purtroppo per tutta la settimana non potrò dedicarti tempo per motivi lavorativi...ti assicuro, però che lunedì o al max martedì prox cercherò di essere più chiara!
ok?!
Scusa ancora |
|
|
|
mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2009 : 09:51:52
|
Allora... se già c'è l'ATG nel tuo plasmide significa che non devi metternene un altro, cioè, devi togliere quello della tua sequenza d'interesse! Stessa cosa se c'è anche lo stop. A questo punto, in base a quelle tabelle di cui parlavamo precedentemente, dovrai add delle basi.
Inserendo su orf finder tutta la tua seq. a partire dal tuo ATG e comprendendo anche i siti per i tuoi enzimi, potrai verificare se la tua seq amminoacidica è cambiata o no.
|
|
|
|
Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 01 aprile 2009 : 20:57:08
|
| Mollichina di pane...ma i nt da aggiungere devono essere per forza quelli scritti nelle tabelle? E può essere che per NotI devoi aggiungere almeno 9 nt prima e dopo e solo con una digestione di 20h hai un'efficinza di taglio del 90%? |
|
|
|
mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2009 : 12:02:26
|
| Io seguo sempre quelle tabelle. Se posso scelgo enzimi a cui non aggiungere troppi nt e che abbiano efficienza almeno al 75% con un'ora. Tra l'altro, lì dove posso, non faccio una reazione di restrizione sequenziale, ma una unica. |
|
|
|
simcrist
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Milano
62 Messaggi |
Inserito il - 17 aprile 2009 : 17:36:45
|
Sono solidale.
Questa è una situazione che ho vissuto anche io.
Questi sono anche i motivi per cui i cervelli fuggono all'estero.
Citazione:
Messaggio inserito da Flap
Ma si può sbagliare ad ordinare dei primers per tre volte...e adesso io devo ricominciare questro maledetto clonaggio per la seconda volta dopo che avevo gia ottenuto il mio bel plasmide. Ma perchè i capi non stanno attenti per quelle poche cose che devono fare? Sette mesi di lavoro buttato. si, ho imparato ma mi rode che per errori di altri forse non farò in tempo a laurearmi ad ottobre. Non è giusto. Voglio andarmene all'estero a fare ricerca appana laureata..dopo quest'esperienza di tesi in quello che dovrebbe essere un laboratorio di ricerca serio in uno deglio ospedali migliori di roma non ho più dubbi. Purtroppo quando i capi se ne fregano la ricerca non va avanti. C'è poco da fare...scusate la sfogo.
|
Dr.Simone Cristoni
ISB srl
laboratori analisi chimiche
Analisi sostanze stupefacenti |
|
|
| |
Discussione |
|
sfogo!
