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Discussione |
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coccinellas
Utente Junior
Città: l'isola che non c'è
138 Messaggi |
 Inserito il - 15 marzo 2009 : 15:11:07
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Salve ragazzi,
ho una domanda x voi.
Ho provato a purificare la proteina che stò studiando.
Ho caricato su un gel sds il purificato, ma quello che vedo sul gel è una banda di 75KDa. Ora il monomero della proteina dovrebbe pesare circa 37KDa.
Credete sia possibile che anche denaturando il campione e caicandolo su sds-page io veda il dimero??????
ciao
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2009 : 15:37:40
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| fai correre il tuo campioni in condizioni riducenti? |
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coccinellas
Utente Junior
Città: l'isola che non c'è
138 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2009 : 16:45:32
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Citazione:
Messaggio inserito da AleXo
fai correre il tuo campioni in condizioni riducenti?
Credo di no!cosa intendi per condizioni riducenti? |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2009 : 17:09:27
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| hai preparato i campioni aggiungendo un agente riducente (beta-mercapto, dtt, tcep...)al loading buffer? (in modo da distruggere eventuali ponti disolfuro) |
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coccinellas
Utente Junior
Città: l'isola che non c'è
138 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2009 : 17:33:13
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Si certo, ho usato mercaptoetanolo!!!
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2009 : 18:08:08
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| controlla la composizione del tampone di corsa e del gel..in entrambi deve esserci dell'SDS. Inoltre ricordati di far bollire i campioni almeno 5 minuti prima di caricarli..ciao |
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coccinellas
Utente Junior
Città: l'isola che non c'è
138 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2009 : 19:29:05
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Citazione:
Messaggio inserito da paolo865
controlla la composizione del tampone di corsa e del gel..in entrambi deve esserci dell'SDS. Inoltre ricordati di far bollire i campioni almeno 5 minuti prima di caricarli..ciao
Ho fatto tutto quello che tu dici:controllare il pH, far bollire i campioni x 10 minuti, ho ripreparato sds!
Ma possibile che il dimero nn si scinde?? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2009 : 20:12:57
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Citazione:
Messaggio inserito da coccinellas
Credete sia possibile che anche denaturando il campione e caicandolo su sds-page io veda il dimero??????
Si capita ed è anche un problema abbastanza comune!!!
Succede sopratutto con proteine altamente idrofobiche.
Però la soluzione "ideale" non esiste, dipende dalla proteina non tutte si comportano allo stesso modo. Le cose che puoi fare sono queste:
- aumentare la % di BME al 5% (questo va bene se il problema è dovuto al fatto che la tua proteina ha molte cisteine e fa molti ponti SS)
- sostituire al BME DTT o TCEP (meglio se riesci a fare entrambe le prove)
- "non bollire" i campioni ma tenerli a temperatura ambiente!!! Lo so può sembrare un controsenso ma è stato visto che aumentando la temperatura certi dimeri tendono a "riformarsi", per questo è anche importante che ti assicuri che non si scaldi il gel!
Prova a fare queste prove e vedi se si risolve il problema.
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2009 : 20:20:54
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Ma...(domanda idiota)...se trasferisci il gel su membrana
e ci fai un western l'Ab riconosce la TUA proteina?
no perchè sennò è inutile affannarsi... |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2009 : 19:53:52
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si il problema e' proprio quello...
che l'anticorpo riconosce anche la forma dimerizzata della proteina.
era questo che intendevi? |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2009 : 21:30:41
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la esprimi in batteri o in cellule?
puo' essere glicosilata? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2009 : 22:37:38
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| Mhm alex dici che forse accozzano perchè mancano gli zuccheri ? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2009 : 22:46:36
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Mhm alex dici che forse accozzano perchè mancano gli zuccheri ?
No penso intendesse che una proteina glicosilata ha un PM maggiore, perchè si "porta dietro" anche gli zuccheri! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2009 : 23:17:21
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| Mh, da 37 a 75 kDa? :/ |
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2009 : 23:39:32
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| ci sono dei paper dove usano delle glicosidasi sui dimeri (oltre al DTT) e fanno vedere come dopo il trattamento ottengono la banda del peso giusto. |
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2009 : 21:24:08
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anche a me una volta è accaduto che una proteina che avevo purificato dimerizzasse. Ne sono venuta fuori preprando un loading buffer non solo con B-mercapto ma anche con 8M Urea (è fortemente denaturante ma come prima volta puoi usare anche 4M Urea). Considera che l'urea però ti rallenta la corsa dei campioni e li fà correre un pò storti. Una volta ho provato ad aggiungere l'urea proprio nel gel secondo un protocollo che avevo letto ma la corsa è stata davvero pessima!
Ciao fammi sapere come va! |
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Rafterman
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2009 : 22:19:24
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| E' un'ottima idea usare l'urea anche se è un pò fastidioso, l'ho usata recentemente.Potresti risospendere i campioni in Sample buffer con urea 6M e volendo li tieni in stufa 15 min a 70 °C, a me ha funzionato. |
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coccinellas
Utente Junior
Città: l'isola che non c'è
138 Messaggi |
Inserito il - 28 marzo 2009 : 11:09:44
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Ragazzi, grazie dei consigli. Vi farö sapere se risolverö il problema.
Baci |
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