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bellastoria
Nuovo Arrivato
Prov.: Bayern
Città: wuerzburg
21 Messaggi |
 Inserito il - 30 marzo 2009 : 10:00:41
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Salve,
Sto mettendo a punto un nuovo western blot per la mia ricerca. Utilizzo degli estratti cellulari per ricercare delle proteine di interesse con anticorpi.
Quando vado a ricercare una delle due proteine.... Jun fosforilato.... il risultato dello sviluppo è una grande membrana nera o grigiastra e le bande delle proteine sono bianche... che significa? qualcuno ha mai avuto la stessa esperienza? Utilizzo il protocollo standard
blocking con latte in polvere 5%
membrana di nitrocellulosa
lavaggi 3x 15 min tbst
Sapete aiutarmi???
grazie
F.
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 11:02:12
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carichi troppo il primario. diluiscilo almeno il doppio o il triplo. mi è capitato una cosa simile una volta.
ciao e fammi sapere se risolvi in questo modo |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 16:05:47
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Si concordo con mattia.dinunzio, prova a diluire l'anticorpo!
Puoi anche provare a diluire l'anticorpo nel blocking.
Il nero della membrana è dato dal fatto che c'è del fondo (che può essere dovuto appunto al troppo anticorpo) e la bande bianche sono dovute al fatto che la reazione è troppo forte e si "brucia" la membrana (forse riesci a vedere anche delle bande marroncine sulla membrana corrispondenti alla bande bianche sulla lastra) |
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bellastoria
Nuovo Arrivato
Prov.: Bayern
Città: wuerzburg
21 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 17:01:57
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Intanto grazie per il vostro aiuto tempestivo, spero di risolvere il problema con la diminuzione dell'Ab primario... vi faccio sapere i risvolti...
grazie
F. |
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Ricciola
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 31 marzo 2009 : 14:18:16
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ciao,
a me succede non di rado con l'actina quando mi viene over-espressa, quindi concordo con gli altri devi abbassare la concentrazione degli anticorpi, in particolare del 1° |
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Wester Blot: bandebianche?? perchè
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