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Discussione |
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
 Inserito il - 24 maggio 2009 : 23:56:46
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Ciao a tutti  !! Sapreste fornirmi delle informazioni,dei links,delle spiegazioni,qualunque cosa... sullo studio di Marshman a proposito delle proprietŕ,del differenziamento, della duplicazione asimmetrica delle cellule staminali adulte e della generazione delle LCR (Label-Retaining Cells), e su come č stato trovato un modello matematico che spiegasse la genesi della cripta nell'epitelio intestinale? So che č un pň complessa come cosa, ma per favore mi serve una mano...   grazie come sempre...
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2009 : 00:28:02
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Simona84
Utente Junior
Cittŕ: milano
131 Messaggi |
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 01 giugno 2009 : 18:38:24
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  Grazie grazie grazieee simi!!!!!!!!  |
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Simona84
Utente Junior
Cittŕ: milano
131 Messaggi |
Inserito il - 01 giugno 2009 : 19:04:29
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di niente!!
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2009 : 12:05:26
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Cosa prevede il metodo della "side-population" per l'indenticazione delle cellule staminali con citometria a flusso?!... |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2009 : 13:24:09
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Le cellule sono marcate con un colorante (Hoechst 33342), in grado di legarsi al DNA delle cellule normali e renderle fluorescenti. L’Hoechst č un bis-benzimide molto lipofilico e quindi in grado di attraversare la membrana cellulare intatta.
In seguito al suo legame al DNA emette sia nel blu a 424/44 nm sia nel rosso a 622/30 nm, una volta eccitato dalle radiazioni ultraviolette (UV 350 nm), ma questo non avviene nelle cellule con caratteristiche di staminalitŕ per l’attivazione dei geni multidrug resistance (MDR). Il fenotipo MDR č associato ad un aumentato efflusso di farmaci dalle cellule mediato da pompe ATP-dipendenti con ampia specificitŕ e con un alterato metabolismo e compartimentalizzazione dei farmaci. Il risultato č comunque una diminuzione del livello intracellulare dei farmaci nei siti bersaglio della loro azione. La presenza di queste pompe determina l’estrusione, oltre che di farmaci genotossici, anche di coloranti come l’Hoechst 33342.
Il saggio prevede che un’aliquota della popolazione cellulare che contiene le putative cellule staminali venga preincubata con Verapamil, un farmaco in grado di bloccare le pompe molecolari che escludono l’Hoechst, perciň confrontando la distribuzione nei canali di emissione dell’Hoechst delle cellule trattate rispetto a quelle non trattate č possibile identificare la regione delle cellule che costituiscono la side population |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2009 : 13:55:29
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| Quindi nella regione della side population, sono presenti le cellule staminali nella popolazione cellulare di interesse, giusto? |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2009 : 14:00:45
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sě o meglio la side population sono le cellule staminali (o presunte tali), stavo cercando di caricare un img dalla mia tesi cosě era piů semplice da capire..ma non ci riesco |
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chick80
Moderatore
Cittŕ: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2009 : 16:30:08
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Usa il link " Rispondi" in fondo alla pagina e da lě potrai allegare il file (max 5Mb, formato jpg, png o gif) |
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2009 : 17:04:06
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Grazie la_fra,giŕ solo cosě, mi hai dato un grande aiuto... inizialmente non avevo per niente capito... GRAZIE DI TUTTO!!!     |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2009 : 18:07:11
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sorry..fatto, in alto ci sono le cellule aderenti incubate con l'hoechst (a dx) e in presenza di verapamil (a sx), la SP č praticamente inesistente. Sotto si ha l'arricchimento in putative CSC, evidenziato dal fatto che la popolazione cellulare mostra una SP maggiore (a dx), che č effettivamente costituita da cellule in grado di escludere l'Hoechst perchč l'incubazione con Verapamil (a sx) fa diminuire in maniera notevole la percentuale
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2009 : 18:36:44
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Ok! Ora, un altro medo per valutare l'esestenza di SC nella popolazione cellulare č quello di testare l'attivitŕ dell'ALDH (Aldeide Deidrogenasi) ? In pratica le cells vengono incubate con BAAA (BODIPY AminoAldeideAcetato) che nell'ambiente intracitoplasmatico č trasformato dall ALDH in BAA (BODIPY AminoAcetato), determinato grazie all'emissione di una fluorescenza verde... il trattamento con un inibitiore dell'ALDH (DEAB----> DietilAmonoBenzaldeide) consente di confrontare le cells trattate da quelle non trattate.... č giusto il ragionamento?
ps. ma come si legge "Hoechst"?
Mille Thanks... |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2009 : 19:10:03
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con la o chiusa senza e, č tedesco con l'ALDH il ragionamento č simile, le SC hanno un'aumentata attivitŕ dell'ALDH ma non tratterrebbero il BAA fluorescente per l'attivitŕ dei trasportatori ABC (ATP-binding cassette) espressi dalle cellule immature. Il DEAB perň inibisce selettivamente questi trasportatori perciň le cellule che cosě acquisiscono la fluorescenza sono le SC che in condizioni normali, a differenza delle altre, eliminerebbero il fluorocromo. Le cellule normali invece trattengono in ogni caso l'aminoacetato perciň sono sempre fluorescenti. Quindi le cellule che dopo trattamento con DEAB sono ALDH"high" (cioč con la fluorescenza maggiore) sono le SC |
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2009 : 23:42:06
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 Sei stata chiarissima!! ti ringrazio tanto !!!
ps.Scusa il ritardo! |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 24 giugno 2009 : 22:27:28
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scusate mi sono accorta di aver scritto una mezza c...ata sull'uso dell'ALDEFLUOR, in realtŕ ho mischiato due cose.. la DEAB č un inibitore dell'ALDH, si usa solo per avere il controllo negativo nel saggio..il discorso dei trasportatori riguarda invece un utilizzo del saggio ALDEFLUOR assieme a quello della SP, perciň utilizzando farmaci come il Verapamil che bloccando le pompe mantiene l'ALDH anche nelle staminali.
Sostanzialmente giŕ con il kit normale si vede un aumento della fluorescenza per l'ALDH nelle cellule staminali, ma dato che tecnicamente queste cellule potrebbero non risultare cosě "bright" come dovrebbero per la concomitante esclusione del composto ad opera dei trasportatori, se si usa il Verapamil si riesce a discriminare ulteriormente la popolazione. Come questo si faccia dal punto di vista tecnico non so spiegarvelo perň, non l'ho mai fatto
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Lemarva
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2009 : 09:37:00
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| raga qlkuno puo spiegarmi un po lo studio di Marsham in cosa consiste e del modello matematico messo appunto xspiegarlo?ho capito ke ha studiato le cell della cripta ma nn ho capito dopo l'uso di dosi differenti di radiazioni cosa ha dimostrato?grazie please |
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2009 : 17:02:49
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Ha dimostrato che, aumentanto l'intensitŕ delle radiazioni e il tempo di esposizione, aumentava il grado e in n° di cells danneggiate, che si trovano sulla sommitŕ della cripta... in questo modo, il resto della cripta non poteva essere rigenerata...
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 ★°•. єѕтяєℓℓα .•°★ |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Cittŕ: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 30 ottobre 2009 : 21:12:14
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la_fra, una curiositŕ! Le cellule aderenti su cui hai lavorato nell'esperimento ke hai riportato, quali erano?
E' ke pensavo ke qsto esperimento sarebbe interessantissimo da fare su cellule derivate da tessuto tumorale murino messe in coltura!!!
Credi si possa fare? o č fantascienza?
P.S. mi sa che io e te abbiamo molte aree di interesse comuni: mi trovo ad intervenire in ogni discussione in cui leggo una tua risp ma nn ti perseguito eh! Giuro  |
Ascoltami con gli occhi... |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2009 : 19:37:53
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quelle erano linee cellulari commerciali di glioblastoma, ma conosco gente che l'ha fatto su altre linee e anche su colture primarie..il protocollo lo puoi applicare su qualsiasi tipologia cellulare, cambiano i tempi e concentrazioni di Hoechst da usare per l'incubazione e di Verapamil.. prova |
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Dionysos
Moderatore
Cittŕ: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2009 : 16:36:15
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Ciao
riapro la discussione perchč mi servirebbe una delucidazione
da parte di la_fra riguardo quello che ha postato, e mi sembra
ingiusto mandare un MP, dato che il thread non č mio, e comunque
si tratta di informazioni che potrebbero interessare a tutti:
Citazione:
in alto ci sono le cellule aderenti incubate con l'hoechst (a dx) e in presenza di verapamil (a sx), la SP č praticamente inesistente. Sotto si ha l'arricchimento in putative CSC, evidenziato dal fatto che la popolazione cellulare mostra una SP maggiore (a dx), che č effettivamente costituita da cellule in grado di escludere l'Hoechst perchč l'incubazione con Verapamil (a sx) fa diminuire in maniera notevole la percentuale
Volevo domandarti innanzitutto in base a quale tipo di controllo
hai impostato quel gate per le Hoechst negative che si vede
in figura. Puoi farlo su un semplice unstained?
Dai grafici sembra che tu abbia deciso di plottare entrambi
i segnali emessi (rosso e blu). A me han detto di usare
soltanto uno dei due. C'č qualche vantaggio a combinarli?
Inoltre se č vero che a sinistra sta il trattamento con
il verapamil, in teoria la SP che hai gatato dovrebbe
sparire in quelle condizioni(cioč le stem cells dovrebbero
comportarsi in modo analogo alle altre, trattenendo il label
e quindi mischiandosi alla nube a maggiore MFI) e invece lě
nel grafico si vedono aumentare le doppio-negative.
Insomma non ho capito bene :/ ...
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontŕ e della libertŕ
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2009 : 19:17:49
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eh, hai ragione a giugno ero un po' esaurita, in realtŕ non avendo fatto fisicamente io la side population non mi ero accorta di aver postato un plot con erroraccio, come dici tu le cellule preincubate con il Verapamil sono quelle di destra e quelle con il solo Hoechst quelle di sinistra! Quello di sinistra perň non č un non marcato, sono cellule della linea aderente/neurosfere marcate con l'Hoechst e basta, questo perchč fare la SP č un casino ci sono mille variabili che possono darti il "codino" di SP, dal tempo di incubazione alla concentrazione di Hoechst alla temperatura.. il confronto tra quello che vedi cosě e la diminuzione di questa quota che osservi quando metti il Verapamil ti permette di capire qual č l'entitŕ della "vera" SP. Le percentuali di SP ottenute per i 2 campioni infatti sono state 0,154% vs 3,43%, considerando come bianco il valore di SP per la linea aderente e NS in presenza di Verapamil, che sono stati sottratti ai rispettivi valori di SP. Infatti la scomparsa della totalitŕ della SP in presenza di Verapamil (per cui hai tutte le cells Hoechst+) ti conferma che sono cellule in grado di escludere il colorante per la presenza di transporter sensibili al Verapamil, non avendo lo 0% in questo caso deduci che la SP reale non č quel 5,23% ma 5,23%-1,8% di cellule che anche con il Verapamil sembrano essere SP (ma che probabilmente per mille motivi sono un artefatto)
Il fatto di vederla blu vs red credo dipenda solo dal fatto che in questo modo distingui abbastanza facilmente il succitato "codino" che rappresenta la SP, io poi l'ho sempre vista fare cosě non so se con una fluorescenza sola (e il SSC?) si distingua meglio
Spero di non aver confuso ulteriormente le idee |
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Dionysos
Moderatore
Cittŕ: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 10 dicembre 2009 : 21:01:03
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Affatto, sei stata chiarissima.
Grazie!
(e augurami in bocca al lupo, spero sia piů agevole del 7-AAD  ) |
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annapalu
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