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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 26 maggio 2009 : 12:47:03
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qualcuno mi può suggerire un protocollo per colorare i nuclei con PI? io dovrei poi andare a guardare le cellule al microscopio a fluorescenza, mentre tutti i protocolli che ho trovato fin'ora si riferiscono all'analisi per citofluorimetria 
thanx 
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
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seabass
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2009 : 13:11:04
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anche io metto qualche goccia di ioduro di propidio al 4% sulle coverslips e i nuclei si vedono bene al microscopio a fluorescenza...sennò usa il DAPI!  |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2009 : 13:25:38
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e non fate alcun trattamento con RNAasi?
io ho trovato in rete un protocollo che dice:
- trattare le cellule con RNAasi (solo se la fissazione è fatta in paraformaldeide)
- equilibrare con un SSC (sodio cloruro + sodio citrato)
- diluire il PI in SSC e lasciare da 1 a 5 minuti
- lavare con SSC
- montare il vetrino
chick scusa, a che concentrazione lo usi? quando lo aggiungi? (prima o dopo la fissazione? prima o dopo lo staining?).
di norma io uso l'hoechst, che aggiungo o alla paraformaldeide o insieme all'anticorpo secondario...ma non so se vale anche per il PI!
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seabass
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2009 : 13:54:46
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Io uso tessuti fissati in PAF... dopo l'anticorpo secondario e gli sciacqui in PBS metti lo ioduro di propidio al 4% con RNAsi al 10% per mezz’ora (io mi occupo di tessuti, ma credo che x le cellule sia =) e poi chiudi con glicerina tamponata
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2009 : 14:14:28
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Citazione:
Messaggio inserito da seabass
Io uso tessuti fissati in PAF... dopo l'anticorpo secondario e gli sciacqui in PBS metti lo ioduro di propidio al 4% con RNAsi al 10% per mezz’ora (io mi occupo di tessuti, ma credo che x le cellule sia =) e poi chiudi con glicerina tamponata
il protocollo che ho io dice che per fissazioni in metanolo/ac acetico il passaggio in RNAasi si può anche evitare, e porta prima uno step per degradare l'RNA e poi un altro per incubare con PI
cmq grazie, tengo in considerazione |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2009 : 15:06:38
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Citazione:
chick scusa, a che concentrazione lo usi? quando lo aggiungi? (prima o dopo la fissazione? prima o dopo lo staining?).
Lo usavo dopo la fissazione. Non facevo altro staining perchè le cellule erano fluorescenti di loro... :)
La concentrazione sinceramente non me la ricordo sorry, comunque ricordo che era molto potente come staining, bastava veramente metterne poco.
Conta che a me serviva solo per colorare il nucleo in modo da vedere dove stavano le cellule, quindi non ho mai fatto ulteriori trattamenti con RNAsi etc., ma magari nel tuo caso possono servire. |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2009 : 15:31:56
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ho capito. in realtà a me serve vedere il nucleo per distinguere le varie fasi del ciclo, se poi riuscissi anche a marcare il Golgi sarebbe perfetto.
alla fine, raccogliendo un po' di info, avrei deciso di procedere così:
fisso in metanolo/ac acetico, NON faccio il trattamento con RNAasi, e poi marco i nuclei con PI nel buffer di sodio cloruro e sodio citrato su un vetrino.
su un altro, invece, fisso in para e faccio anche il trattamento con RNAasi...e vediamo che ne viene fuori! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2009 : 16:26:54
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Citazione:
Messaggio inserito da Iside
...alla fine, raccogliendo un po' di info, avrei deciso di procedere così:
fisso in metanolo/ac acetico, NON faccio il trattamento con RNAasi, e poi marco i nuclei con PI nel buffer di sodio cloruro e sodio citrato su un vetrino.
su un altro, invece, fisso in para e faccio anche il trattamento con RNAasi...e vediamo che ne viene fuori!
Vera mentalità scientifica!!!  |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2009 : 17:23:58
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Vera mentalità scientifica!!!
cosa non si fa per la scienza  |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 01 giugno 2009 : 17:38:36
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lo staining è pessimo, con e senza trattamento con RNAsi!!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 01 giugno 2009 : 22:57:13
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 mi spiace!
Io non l'ho mai usato e non saprei cosa consigliarti! |
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ukitel
Nuovo Arrivato
78 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2009 : 18:56:06
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Il trattamento con le RNAsi ti serve nella citofluorimetria perché il PI finisce per intercalarcisi e quindi altera la quantizzazione del DNA, visto che è utilizzato essenzialmente per quello.
Siccome al microscopio a fluorescenza dopo una fissazione l'RNA molto probabilmente l'hai perso, questo trattamento lo puoi evitare, inoltre è disperso nel citoplasma per cui forse in ogni caso non riuscirebbe a raggiungere un'intensità tale da ostacolarti.
Ti chiedo una cosa... Il PI ha bisogno dell'antifade come il DAPI? Perché se sì e se non l'hai usato la colorazione è, appunto, pessima, manca di contrasto.
Non ho capito bene cosa ci devi fare, ma se vuoi quantizzare al microscopio a fluorescenza la quantità di DNA nucleare e capire in che fase del ciclo si trova la cellula... A quanto ricordo è molto meglio l'Hoechst.
Se il tuo campione è citologico, o non ti interessa l'architettura tissutale è inutile la fissazione in paraffina, che peraltro ti ostacola qualsiasi lavaggio, reazione, colorazione, ecc.
Infine non mi ricordo di preciso quale, ma uno dei coloranti fluorescenti utilizzati per il DNA tipo DAPI, Hoechst e PI marca debolmente anche il golgi... Forse è proprio il PI come dicevi tu.
Magari se ci posti un'immagine o ci dici cosa hai visto, o nello specifico cosa vorresti fare, potremmo darti una mano in più. |
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protocollo propidio ioduro
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