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andrea_newuser
Nuovo Arrivato
37 Messaggi |
 Inserito il - 28 maggio 2009 : 18:04:53
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Eccomi di nuovo :)
Oggi mi è stata fatta questa domanda: cerca su internet qualcosa riguardo il triton X-100 e il ghiaccio.
Qua nel protocollo usiamo solitamente 998 microlitri di Dulbecco's PBS e 2 di Triton X-100, poi ne mettiamo 100 microlitri sul vetrino posto su ghiaccio e lasciamo agire 5 minuti.
Il problema è che si vede del citoplasma in giro una volta che si guardano i vetrini colorati al microscopio.
Oggi abbiamo provato a usare il triton 10 minuti e non su ghiaccio, ma comunque freddo. Il risultato non sembra molto diverso.
Voi che alternative proponete?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2009 : 18:38:27
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Non ci hai detto le cose principali... cioè che colorazioni fate? Perchè usate il Triton etc.
PS: i 2 ul li puoi aggiungere direttamente in 1 ml... non c'è bisogno di essere così precisi per questo tipo di diluizioni! |
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andrea_newuser
Nuovo Arrivato
37 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2009 : 21:22:39
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Usiamo un anticorpo primario anti "gamma H2AX", come secondario RAM-TRITC. Poi aggiungiamo dapi+gelmount. Il triton lo usiamo come permeabilizzante. Per la diluizione hai perfettamente ragione :) ma mi attengo al protocollo, dato che sono parecchio fiscali questi signori.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2009 : 21:48:59
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Scusa se ho capito bene il tuo problema è che vedi la colorazione anziché nucleare, anche nel citoplasma!
Hai provato un metodo di fissazione diverso?
Usi PFA? Magari prova con acetone!
(io il Triton non l'ho mai utilizzato in ghiaccio comunque)
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
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andrea_newuser
Nuovo Arrivato
37 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2009 : 11:06:12
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Citazione:
Messaggio inserito da angemore
Può esserti utile?
http://www.jhc.org/cgi/reprint/33/8/813
certo grazie :)
Questa mattina al metafer4 sono piaciuti molto di più i vetrini con cellule fissate con PFA3% invece che con formaldeide 4%.
Alcune cellule nei vetrini con formaldeide 4% sono deformate, si è pensato di centrifugare i vetrini al citospin a 800 invece che 1000 rpm per 10 minuti...però non so se ha senso, visto che probabilmente continueremo ad usare la PFA...giustamente queste problematiche escono ad un solo mese dal mio ritorno a casa hahahaha! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2009 : 13:04:49
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Beh magari una centrifugazione ad una velocità ridotta può servire.
Comunque io una prova con acetone o metanolo la farei, visto che parlavi di una proteina istonica. In genere per l'immunofluorescenza di proteine nucleari si ottengono risultati migliori con questi fissativi piuttosto che con formaldeide o PFA. |
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ukitel
Nuovo Arrivato
78 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2009 : 21:52:11
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Nel cytospin, effettivamente si nota differenza tra 800 e 1000 rpm. Le cellule vengono meno schiacciate, tuttavia i nuclei meno schiacciati significa anche minore penetrazione.
Comunque se osservi una colorazione ANCHE citoplasmatica vuol dire che il triton ha funzionato, e che il problema è un altro. Se il segnale nucleare è presente l'alone fluorescente che osservi è aspecifico.
Secondo me devi provare lavaggi più stringenti, potrebbe essere successo che una delle soluzioni che usi per i lavaggi è stata ripreparata, se usi skimmed milk, oppure BSA per il blocco dei siti aspecifici potrebbe darsi che usando una nuova aliquota sia da riaggiustare qualcosa.
Anche io ti consiglio un fissaggio in acido acetico e metanolo, o comunque una fissazione che agisce tramite precipitazione. Se vuoi evidenziare qualcosa nel nucleo, ricorda che lì dentro è tutto condensato, e se usi un agente fissante cross-linkante come formaldeide o PFA l'anticorpo ha più difficoltà a penetrare, non a caso hai trovato risultati migliori nei vetrini in cui le cellule sono state fissate in maniera più "dolce". |
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Triton X-100
Didattica e Relazioni
