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mikymiky
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: lonato
45 Messaggi |
 Inserito il - 27 giugno 2009 : 22:00:44
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salve a tutti!
so che ci sono già altre discussioni in merito, ma la mia è una domanda ben specifica, cui non ho trovato risposta negli altri post:
quando precipito RNA, in presenza di sali(tipo NaAc) e EtOH 100%, abbiamo che acido nucleico e sali precipitano, poichè il Na si lega al gruppo fosfato dell'RNA e sono insolubili in etanolo. e fin qui ci sono!
ma gli Ac (carica negativa) cosa fanno? rimangono in soluzione??
e poi, quando faccio i lavaggi con EtOh 70%, cosa succede esattamente?? io ho scritto che i sali si sciolgono in acqua, e quindi vengon lavati via, mentre l'RNA rimane come pellet! E' corretto?
grazie infinite! :-)
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2009 : 23:33:04
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Citazione:
poichè il Na si lega al gruppo fosfato dell'RNA
non è che proprio si lega, ma si creano delle forze elettrostatiche tra il gruppo fosfato e Na+, è in realtà una neutralizzazione delle cariche negative dell'acido nucleico che quindi risulta meno solubile e tende a precipitare.
Il ruolo dell'alcool in tutto questo è dato dal fatto che ha una costante dielettrica inferiore a quella dell'acqua e questo favorisce l'interazione tra Na+ e PO3-, che altrimenti in acqua è più sfavorita. (secondo la legge di Coulomb)
Citazione:
gli Ac (carica negativa) cosa fanno? rimangono in soluzione??
Si CH3COO- rimane in soluzione.
Citazione:
quando faccio i lavaggi con EtOh 70%, cosa succede esattamente?? io ho scritto che i sali si sciolgono in acqua, e quindi vengon lavati via, mentre l'RNA rimane come pellet! E' corretto?
si i sali si sciolgono in acqua, perchè viene meno l'interazione (per il motivo detto sopra) e vengono lavati via, l'acido nucleico precipitato invece non si scioglie subito, in questo modo è possibile eliminare i sali. Poi eliminando completamente l'alcool e mettendo l'acido nucleico in acqua (o in un tampone tipo TE) ed eventualmente innalzando la temperatura si avrà la dissoluzione del pellet in acqua.
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mikymiky
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: lonato
45 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2009 : 00:18:32
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ok perfetto! grazie mille!
e quindi quando faccio le purificazioni sulle colonnine in silice (o eppendorf con filtro), il principio è sempre lo stesso? cioè, nella soluzione di binding ho un eccesso di sali, che aumenta l'affinità del DNA o RNA per la matrice, legandolo ad essa, mentre nei lavaggi successivi i sali vengono lavati via in fase acquosa e l'acido nucleico rimane ancora legato. Infine con la elution solution (che contiene diH2O), si può staccare?!?!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2009 : 23:52:00
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Si è più o meno così, in realtà sono presenti anche agenti caotropici che aiutano il legame del DNA con la matrice di silice.
Comunque il concetto è quello.
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mikymiky
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: lonato
45 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2009 : 10:17:06
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grazie grazie grazie  |
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