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iago
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Città: Roma
11 Messaggi |
 Inserito il - 10 luglio 2009 : 20:09:52
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salve a tutti, è la prima volta che intervengo sul forum - che, comunque, ho sempre seguito a scopo didattico (:
il mio problema ha a che fare con una nick translation, ed è il seguente: sto lavorando sull'ibridazione in situ, e, essendo ancora all'inizio del progetto, sono indaffarato con le sonde. per ora ho quattro campioni di DNA da marcare, tramite nick translation, sia in green che in orange (2+2), per usarli, poi, come sonde, per l'appunto.
premetto che uso lo stesso kit per entrambe le marcature, aliquote degli stessi reagenti e, ovviamente, stesse condizioni sperimentali (i dUTP marcati sono anche della stessa casa produttrice del kit).
detto ciò, qualcuno saprebbe spiegarmi come mai, ad ogni marcatura, i miei Green-dUTP risultano sempre non incorporati, mentre l'Orange non dà mai nessun problema?
(non dovrebbe essere un problema di fornitura o di contaminazione, visto che anche il secondo campione di GreendUTP - aperto oggi - mi dà lo stesso problema)
grazie in anticipo a chiunque mi risponda o si sforzi di trovare una soluzione (:
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ukitel
Nuovo Arrivato
78 Messaggi |
 Inserito il - 15 luglio 2009 : 12:12:25
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Che vuol dire che non ti sembrano incorporati?
Cos'è che noti di preciso? |
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iago
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
11 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2009 : 16:39:21
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praticamente, dopo l'incubazione con polimerasi e dUTP marcati faccio correre 3-5 uL di campione in gel d'agarosio (1.5%) per valutare le dimensioni delle sonde ottenute.
il segnale Orange si ferma tra 400 e 500 bp, mentre per quelle marcate in Green ho solo lo smear di DNA dovuto al bromuro d'etidio, e il segnale fluorescente verde è sul fondo della lane, il che sta a indicare l'accumulo dei soli dUTP verdi che non si sono incorporati. |
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ukitel
Nuovo Arrivato
78 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2009 : 23:53:57
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Beh, immagino che voglia dire che la polimerasi che usi ha problemi ad incorporare il nucleotide marcato. Se è questo il problema devi cambiare fluorocromo, o polimerasi nella speranza di trovarne un paio compatibili. Potresti fare anche un tentativo modificando il rapporto dTTP/dUTP-marcato, potrebbe migliorare la situazione.
Una curiosità: stai usando mica spectrum green - dUTP (vysis o enzo)? |
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iago
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
11 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2009 : 09:33:09
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il punto è che la stessa polimerasi non mi crea problemi con l'orange dUTP, ho provato anche a cercare in rete se il fluorocromo verde potesse creare dei problemi dal punto di vista sterico, ma, a quanto pare, in letteratura, lo usano tutti senza problemi.
avevo pensato anch'io di cambiare il rapporto dTTP/dUTP o, addirittura, di eliminare proprio i dTTP e provare una specie di incorporazione forzata dei dUTP, tenterò appena torno in laboratorio (:
ah, comunque sì, uso lo Spectrum Green Vysis (come anche lo spectrum orange).
grazie dell'aiuto (: |
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ukitel
Nuovo Arrivato
78 Messaggi |
Inserito il - 22 luglio 2009 : 12:44:31
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Sì, prova così, comunque inizio a sospettare di aver lo stesso problema tuo.
In letteratura mi sono fatto l'idea che lo evitano in favore dell'orange, quindi potrebbe darsi che qualche taq abbia problemi ad incorporarlo, però mi sembra assurdo che un fluorocromo pensato specificamente per questo tipo di applicazione dia problemi simili.
Potrebbe darsi che sia un problema di lotto... Oppure boh.
Io uso le taq della Roche, anche tu? |
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iago
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
11 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2009 : 14:01:41
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no, io uso una miscela enzimatica di DNAasi e polimerasi fornita sempre dalla Abbott-ex-Vysis nel kit per la nick translation.
ad ogni modo, ho provato, ieri, ad eliminare l'aggiunta di dTTP e aumentare l'aliquota di spectrumGreen da 2.5 a 3.5 uL. il risultato è sempre lo stesso, nessuna incorporazione dei nucleotidi marcati. |
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madoka
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3 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2009 : 18:19:15
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ciao, non so se il mio parere ti potrà essere d'aiuto.
io faccio spesso marcature di BAC-DNA con spectrum orange e green della vysis. anche io noto differenza nel gel di agarosio che faccio dopo la marcatura, ma questa è dovuta al diverso fluorocromo, infatti la FISH mi viene sempre abbastanza bene. ti consiglio dunque di procedere con l'esperimento facendo la marcatura come indicato nel protocollo vysis e facendo una FISH su sangue periferico per vedere se effettivamente il tuo DNA è stato marcato.
Ciao |
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