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mrgorefest
Nuovo Arrivato
Prov.: BA
Città: Bari
9 Messaggi |
 Inserito il - 11 luglio 2009 : 10:48:33
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Salve a tutti.
Vorrei capire i meccanismi alla base di ciò che ho fatto in laboratorio per l'estrazione del plasmide da E. coli mediante il metodo della lisi alcalina e la purificazione mediante cromatografia per adsorbimento (colonna con silice al fondo).
Abbiamo utilizzato un kit commericale (della QIAGEN credo) fornito di 3 buffer usati di seguito: P1 (EDTA, Tris e RNAsi), P2 (SDS in NaOH), N3 (Acido acetico e Acetato di Potassio).
Eccovi i miei dubbi (spero riusciate a leggerli tutti, senza annoiarvi :P ):
1) Perché NaOH denatura il DNA?
2) In che modo la soluzione N3 provoca la neutralizzazione del pH? La soluzione di Acido acetico e di Acetato di Potassio non dovrebbe essere una soluzione tampone?
3) Perché quando ho aggiunto la soluzione N3 si è formato un precipitato biancastro? Il prof. ci ha detto che è costituito dal DNA cromosomico. Ma perché? E le proteine perché sono precipitate insieme al DNA cromosomico?
4) Dopo la precipitazione abbiamo centrifugato e il sovranatante (contenente il plasmide) lo abbiamo messo su una colonnina cromatografica contenente silice al fondo. Dopo la prima eluizione abbiamo lavato la resina da sali e altri contaminanti con etanolo. E perché con l'etanolo? Non dovrebbe provocare la precipitazione del DNA proprio perché favorisce l'attrazione tra gli ioni del sale e i fosfati?
5) Perché in alcuni protocolli il DNA plasmidico viene lavato con etanolo al 70%? Non si potrebbe utilizzare l'acqua?
6) Il plasmide poi l'abbiamo fatto correre su gel di agarosio allo 0.8%. Il tampone di corsa è il TAE. A che serve l'acetato in questo tampone?
Spero che mi possiate aiutare perché sto impazzendo per cercare di capire queste cose.
Grazie mille.
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