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Ma aa questo punto, tra l'altro, dato che il frammento è lo stesso per tutti, sarebbe davvero necessario tagliare con l'enzima? o basterebbe valutare l'amplimero che avrebbe +3bp nel caso del T18....

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Messaggio inserito da GFPina

Sinceramente mi sembra che il metodo più semplice, veloce e fattibile sia il gel di poliacrilamide. L'agarosio low melting è semplicemente un agarosio che si scioglie a T inferiore.

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Non ho capito i tui dubbi sul gel di poliacrilamide, semplicemente fai correre i tuoi frammenti sul gel e migreranno in base al PM, hai un potere di risoluzione migliore rispetto ai gel di Agarosio e quindi puoi discriminare anche per poche bp.

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Ma aa questo punto, tra l'altro, dato che il frammento è lo stesso per tutti, sarebbe davvero necessario tagliare con l'enzima? o basterebbe valutare l'amplimero che avrebbe +3bp nel caso del T18....

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puoi metterlo tutto (quanto è grande?), comunque discrimini in base al PM quello con le 3 basi in più o in meno.

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e in base a cosa la differente temperatura di fusione sarebbe utile a discriminare bande che differiscono per 3bp?

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Messaggio inserito da Dionysos

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e in base a cosa la differente temperatura di fusione sarebbe utile a discriminare bande che differiscono per 3bp?

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In base al fatto che se provi a colare un gel di agarosio con una percentuale
superiore al 4% è probabile che questo si sciolga poco e male e che venga fuori
un gel irregolare, che corre male. Se invece usi il low melting non hai di questi
problemi e puoi fare gel sufficientemente concentrati per separare 'pesci piccoli'

Certamente è inferiore al gel di poliacrilamide, ma sicuramente più rapido da preparare

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Messaggio inserito da Sandrus86

grazie per la tabella. al 20% separa minimo 6bp.... non basta purtroppo.... :(

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Messaggio inserito da GFPina

Si ma il problema era chiarissimo!
Mi mancava solo di sapere quanto era la grandezza della banda che devi discriminare, ora lo so 270bp.
A questo punto se hai T18 la banda sarà 270 e se hai T15 sarà 267.
Io proverei con un gel attorno all'8% (60-400bp), in mezzo (più o meno) avrai la banda che devi discriminare.
Riprendendo dal tuoi schema otterrai una cosa del genere:


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Non è detto che funzioni tutto la prima volta!
Dovrai mettere a punto un po' di condizioni, ma fai una prima prova partendo con un gel 8% e vedi com'è la risoluzione al massimo aumenti o diminuisci la % di acrilamide (è più verosimile che dovrai aumentarla, ma devi vedere tu dai risultati).
Spero tu abbia dei controlli! Sarebbe molto più facile mettere a punto il tutto!
Se riesci a giocare bene con le % del gel puoi anche riuscire a discriminare T14 e T16, non è impossibile, solo devi mettere a punto la cosa.
Altra cosa che puoi fare è comprati un marker adeguato (non so dovresti cercare un po') e metterlo a punto utilizzando il marker per vedere com'è la migrazione alle varie %.

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